Plataformas de Expresión de Proteínas Recombinantes: Un Recorrido por Sistemas Biológicos

Sistemas de Expresión en Levaduras

Las levaduras, como todas las células eucariotas, poseen mecanismos de modificación post-traduccional, aunque con patrones de glicosilación específicos.

• Crecimiento rápido (aproximadamente 90 minutos), sencillo y económico.

El Sistema GAL es una vía de conversión de galactosa en glucosa-6-fosfato, activado por el crecimiento en placas suplementadas con galactosa como única fuente de carbono.

• Permite una alta expresión de los genes estructurales GAL (0,5-1% del ARNm total de la célula).
• El activador transcripcional Gal4p está regulado por el promotor GAL1.
• El gen de interés debe ser clonado en un vector bajo el control del promotor GAL1 (galactoquinasa).
• Este sistema produce múltiples copias del activador Gal4p, lo que permite el uso de vectores multicopia y, consecuentemente, una mayor traducción de la proteína de interés.

Sistemas de Expresión en Células de Insecto

• Las líneas celulares de insecto ofrecen la ventaja de realizar modificaciones post-traduccionales complejas.
• Los baculovirus infectan tanto insectos como líneas celulares de insecto.
• Estos virus producen cuerpos de oclusión (polihedrina) que protegen al virión.
• El promotor del gen de la polihedrina, presente en los vectores de baculovirus, permite una alta expresión de la proteína de interés (a menudo utilizando tecnologías como Gateway Technology).
• El Baculovirus nuclear poliédrico de Autographa californica (AcNPV) es ampliamente utilizado como sistema de expresión en líneas celulares de Spodoptera frugiperda.
• Se utilizan proteínas asociadas a la producción de la cápside (como ORF603-1629) y el promotor de la polihedrina (PPH).
• La recombinación homóloga (un sistema de reemplazo mediado por sitios attR y la enzima Clonasa II) es clave para la inserción del gen.
• Esto resulta en un genoma viral recombinante de baculovirus con un promotor fuerte como el PPH.

Sistemas de Expresión en Células de Mamífero

El Sistema Tet-on/Tet-off permite el control de la expresión génica mediante un represor de tetraciclina (similar al represor lacI bacteriano).

• El antibiótico tetraciclina tiene una alta afinidad de unión con la proteína represora TetR.
• Componentes clave incluyen:
  • VP16: un dominio activador transcripcional.
  • TRE: un elemento de respuesta a tetraciclina.

Sistema Tet-off

• En ausencia de tetraciclina, el complejo TetR-VP16 se une al TRE y activa la transcripción del gen de interés.
• La adición de tetraciclina provoca la disociación del complejo, agotando la expresión.

Sistema Tet-on

(Utilizando una proteína TetR mutante, rTetR):

• El represor solo se une al ADN en presencia de tetraciclina, lo que activa la expresión.
• En ausencia de tetraciclina, el complejo rTetR:VP16 se separa del TRE y la expresión se agota.

Expresión de Proteínas Heterólogas en Hospederos Vegetales

• El gen de la proteína deseada puede insertarse en el genoma nuclear, cloroplástico o en un tejido específico de la planta bioamplificadora.
• En el Biofarming (o biofabricación vegetal), las células vegetales son capaces de realizar plegamientos complejos y modificaciones post-traduccionales (como la glicosilación), lo que resulta en proteínas con actividad biológica completa.
• Los sistemas de expresión en plantas se dividen en:
  • Expresión estable: el transgén se integra en el genoma.
  • Expresión transitoria: el transgén no se integra, pero se expresa temporalmente.
• La entrega del casete transgénico se puede realizar mediante:
  • Biolística.
  • Micromanipulación.
  • Métodos mediados por especies de Agrobacterium o no-Agrobacterium (como vectores virales).

Ventajas del Uso de Plantas como Biofábricas

1. Fácil crecimiento, con requisitos básicos de CO2 y minerales.
2. Bajo consumo de agua.
3. Adaptabilidad al cultivo in vitro.
4. Sistema de producción escalable.

Estrategias para la Expresión de Alto Nivel de Transgenes

• Dicotiledóneas: Se utiliza comúnmente el promotor CaMV 35S.
• Cereales: Se emplea el promotor Ubiquitin-1 de maíz.

Biofabricación Molecular Basada en Cloroplastos

Ofrece una mayor expresión que la obtenida en el ADN nuclear, pero presenta ciertas limitaciones:

• Deficiencia en modificaciones post-traduccionales: Los cloroplastos tienen una capacidad limitada para realizar ciertas modificaciones post-traduccionales.
• Movilización del transgén: Riesgo de transferencia horizontal del transgén desde plantas transplastómicas hacia bacterias, lo que implica consideraciones de bioseguridad en condiciones de laboratorio.