PCR: Tipos, Componentes y Consideraciones Clave para la Amplificación de ADN

PCR: Tipos, Componentes y Consideraciones Clave

CE (i)

• La PCR cualitativa permite detectar la presencia o ausencia de un fragmento de ADN determinado. Se emplea para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
• La PCR semicuantitativa permite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm) en particular, y normaliza los niveles encontrados del gen de interés con los encontrados en un gen de expresión constitutiva, que se expresa de manera constante en la célula.
• En una PCR cuantitativa, el producto de PCR es cuantificable, lo que permite reportar en números absolutos la cantidad de un microorganismo o del ARNm de un gen en una muestra.

La semicuantificación puede ser respecto a cualquiera de las muestras contenidas en el gel, o bien respecto a un gen constitutivo (aquel indispensable para la viabilidad celular y que presenta una expresión constante que no se altera por la presencia de enfermedades).

Lo más eficiente para analizar el tamaño de los fragmentos de ADN son marcadores de peso molecular. Estos marcadores comerciales permiten determinar por comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos (escaleras) o proteínas contenidas en las muestras sometidas a electroforesis.

CE (b, c, d, e)

Componentes Esenciales de la PCR

ADN polimerasa: La Taq ADN polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus tiene como función polimerizar una nueva cadena de ADN tomando como molde otra ya existente.

ADN molde: Molécula de ADN cuya secuencia sirva de molde para la amplificación. Si se quiere amplificar ARN, antes de la PCR se requiere realizar una reacción previa: la retrotranscripción, que permite convertir el ARN en ADNc.

Soluciones buffer: Estas soluciones proporcionan el pH y concentraciones de sales adecuadas para la correcta función de la ADN polimerasa.

Desoxinucleótidos: Para que la polimerasa lleve a cabo su función necesita que existan desoxinucleótidos en la mezcla de reacción para poder sintetizar la nueva hebra del ADN.

Cloruro de magnesio: Actúa como cofactor de la ADN polimerasa. Un exceso de magnesio produce una amplificación inespecífica de productos de PCR, mientras que una baja concentración disminuye la producción del amplificado.

Iniciadores (Primers): Se usan para reconocer por complementariedad secuencias blanco en el ADN molde. Su función radica en proporcionar un extremo 3’ libre al que se añaden los nucleótidos por enlace fosfodiéster, ya que la ADN polimerasa requiere iniciar la síntesis partiendo de un extremo 3’OH. Un exceso favorecería la formación de dímeros entre dos primers parcialmente complementarios de un primer con él mismo.

Consideraciones Clave para el Diseño de Iniciadores

Debemos tener en cuenta:

• La secuencia de los iniciadores debe ser altamente específica para el gen de interés.
• La secuencia debe tener un contenido de nucleótidos G-C de 40 a 60%.
• Debe evitarse un diseño que permita la complementariedad o la formación de estructuras secundarias inter e intra-primers.
• La longitud óptima de los primers está entre los 18 y 30 nucleótidos.
• Los primers deben ser lo más puros posible.

Termociclador: Equipo que realiza la PCR. Cambia la temperatura de la muestra en segundos; se logra mediante calentamiento/ enfriamiento por resistencia eléctrica de una placa metálica. Evita que la concentración de solutos se modifique.