PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa, Etapas, Componentes y Aplicaciones

Introducción a la PCR

En 1986 surgió un método para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN, sin necesidad de recurrir a los vectores y su replicación en bacterias. La técnica PCR permite replicar cientos de miles y millones de veces, en pocas horas e in vitro, pequeños fragmentos de ADN, con gran rapidez y eficiencia.

Etapas de la PCR

Etapa 1: Desnaturalización

La muestra se calienta para lograr la separación de las 2 cadenas que constituyen el ADN.

Etapa 2: Hibridación

La temperatura se reduce para permitir la hibridación de los cebadores con cada una de las hebras separadas del ADN molde.

Cebadores: segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de tal manera que permiten los límites del fragmento de ADN que se desea replicar.

Etapa 3: Extensión

La ADN polimerasa utiliza el anclaje de la cadena doble que se ha formado con los primers y sintetiza las cadenas complementarias al fragmento molde, extendiendo la secuencia. Utiliza dNTPs.

Componentes de la PCR

• ADN polimerasa: enzima que lleva a cabo la síntesis de ADN a partir de un ADN molde. La más empleada en PCR es la Taq polimerasa.
• Termociclador: equipos automatizados que controlan los cambios de temperatura necesarios en cada ciclo.
• Primers:
  • Constituyen el factor más importante para la eficiencia y especificidad de una PCR.
  • Son fragmentos cortos de ADN de secuencia conocida.
  • Son específicos para cada fragmento de ADN.
  • Se utilizan en pares.

Ventajas y desventajas de la PCR

• Ventajas: sensibilidad muy alta.
• Desventajas: riesgo de falsos positivos por contaminación.

Aplicaciones de la PCR

Clonación de genes conocidos y desconocidos

• Diseño de cebadores a partir de la secuencia que se quiere aislar.
• Elección del material de ADN de partida.
• Reacción de PCR.
• Análisis de productos de PCR.
• Análisis de restricción.

RT-PCR

Medida relativa de la expresión de un gen determinado en distintos tejidos.

PCR de colonias transformantes

Consiste en realizar PCR directamente con colonias bacterianas.

Mutagénesis

• Al azar: altas tasas de error durante el proceso de amplificación.
• Con oligonucleótidos solapantes: introducir una mutación en un lugar concreto mediante el empleo de cebadores que contienen el cambio que se desea introducir.

Diagnóstico

La PCR detecta secuencias de ADN, siendo una herramienta valiosa para la medicina.

PCR cuantitativa o PCR en tiempo real

Permite detectar en tiempo real la amplificación del fragmento de ADN. Se basa en usar otro fragmento corto de ADN complementario a una secuencia intermedia del ADN a amplificar.

1. Amplificar la región de ADN.
2. Intensidad de señal fluorescente.
3. Comparar el Ct frente a una curva estándar.

Ventajas de la PCR en tiempo real frente a la PCR

1. El incremento de fluorescencia es directamente proporcional al número de amplificaciones generadas.
2. Mayor precisión, resolución y sensibilidad.
3. No se requiere ningún proceso post-PCR.
4. Permite la realización de ensayos multiplex.
5. Los equipos actuales facilitan realizar ensayos con un gran número de muestras.