Optimización de Bioprocesos: Métodos de Separación, Purificación y Cromatografía (HPLC, FPLC)

Procesos Clave en la Recuperación y Purificación de Productos Biológicos (Downstream Processing)

1. Separación de Células del Caldo de Fermentación

Objetivo: Eliminar las células del medio líquido para recuperar el producto intracelular o extracelular.

• Centrifugación: Separación de células de un cultivo de E. coli del sobrenadante para recuperar proteínas recombinantes.
• Filtración Tangencial (Microfiltración): Separación de levaduras de un medio fermentado, crucial en la producción de etanol.

2. Aislamiento Primario

Objetivo: Eliminar componentes muy distintos al producto (baja selectividad, pero permite tratar grandes volúmenes).

• Precipitación con Sulfato de Amonio: Concentración de proteínas mientras se eliminan otras sustancias solubles.
• Extracción Líquido-Líquido: Aislamiento de antibióticos (ej. penicilina) desde el medio de cultivo hacia un disolvente orgánico.

3. Purificación

Objetivo: Eliminar impurezas que son química o físicamente similares al producto (alta selectividad).

• Cromatografía de Intercambio Iónico: Separación de proteínas con cargas distintas, pero estructuras similares.
• Cromatografía de Afinidad: Purificación de anticuerpos monoclonales mediante su interacción específica con un ligando.

4. Aislamiento Final

Objetivo: Obtener un producto altamente puro y concentrado, listo para formulación o almacenamiento.

• Liofilización: Conservación de una enzima purificada en polvo seco.
• Ultrafiltración Concentradora: Reducción de volumen y aumento de concentración de una solución de proteína sin desnaturalizarla.

Fundamentos y Aplicaciones de la Cromatografía

Técnicas Avanzadas de Cromatografía Líquida

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

HPLC es una técnica cromatográfica que se utiliza para separar, identificar y cuantificar componentes en una mezcla. Funciona haciendo pasar una solución líquida (fase móvil) a través de una columna llena de partículas muy pequeñas (fase estacionaria) a alta presión.

• Aplicaciones: Purificación de fármacos, proteínas o compuestos bioactivos con alta resolución.
• Ejemplo: Separación de hormonas en un extracto biológico.

Cromatografía Líquida Rápida de Proteínas (FPLC)

FPLC es una variante de la cromatografía líquida diseñada específicamente para purificar proteínas en condiciones suaves. Utiliza presiones más bajas que el HPLC y está optimizada para evitar la desnaturalización de las proteínas.

• Aplicaciones: Purificación de proteínas recombinantes en procesos biofarmacéuticos.
• Ejemplo: Purificación de insulina o anticuerpos monoclonales.

Clasificación de Métodos Cromatográficos

1. Cromatografía en Capa Fina (TLC)

   • Soporte plano.
   • Usada para identificación rápida.

2. Cromatografía de Columna

   • Fase estacionaria empacada.
   • Versátil y ampliamente usada.

3. HPLC (Alta Eficacia)

   • Alta presión, alta resolución.
   • Cuantificación y caracterización.

4. FPLC (Rápida para Proteínas)

   • Condiciones suaves, ideal para biomoléculas.

5. Cromatografía de Gases (GC)

   • Especializada en compuestos volátiles.

Conceptos Clave en Cromatografía

• ¿Qué significa un número alto de platos teóricos (N)? Mayor eficiencia de separación.
• ¿Qué fase móvil se usa en HPLC? Líquidos como mezclas de agua con metanol, acetonitrilo u otros solventes orgánicos.
• ¿Qué aplicación tiene la FPLC? Purificación de proteínas bajo condiciones suaves.
• ¿Qué ocurre si se aumenta mucho el caudal en HPLC? Disminuye la resolución de los picos.
• ¿Qué significa que un compuesto tenga kP = 0 en cromatografía de gel? Que es demasiado grande para penetrar los poros y eluye con el volumen vacío.

Principios Físicos de la Centrifugación

Centrifugación

Fuerzas que Intervienen en el Proceso

Fuerza Centrípeta

Siempre actúa en forma perpendicular a la dirección de movimiento del cuerpo sobre el cual se aplica.

Fuerza Centrífuga

Es la que tiende a alejar los objetos del centro de rotación mediante la velocidad tangencial, perpendicular al radio, en un movimiento circular.

Fuerza Friccional

Se genera en la superficie del tubo de ensayo (con una muestra) causada por el movimiento del aire alrededor de esta.