Microscòpia: tipus i aplicacions

Microscòpia de camp lluminós

És el microscopi més utilitzat en els laboratoris clínics i en anatomia patològica. La font de llum és el visible (λ= 400 a 700 nm). S'utilitzen bombetes de tungstè o led. Aquesta λ, ens condicionarà el Poder de Resolució (PR) que serà de 0,2 µm.

Microscòpia de llum ultraviolada

És un microscopi òptic on es treballa amb llum UV. Aquesta llum té λ= de 180 a 400 nm i en conseqüència permet un major PR. Aquests microscopis usen la llum ultraviolada (λ= de 180 a 400 nm). La llum UV és invisible per l'ull humà i és molt perjudicial. Les lents, els portaobjectes i cobreobjectes estan fets de quars o fluorita. (No poden ser de vidre perquè no transmet la llum UVA). La imatge no s'observa directament amb els oculars, sinó que hi ha un sensor que reacciona a la llum UV incident i reconstrueix la imatge de la mostra. Aquesta imatge es pot observar a una pantalla d'ordinador. És un microscopi que té un preu molt elevat, per les imatges que es poden obtenir. Els laboratoris opten per la compra de microscopis de fluorescència que permeten millor resultat a l'hora de fer les observacions. Les imatges obtingudes són semblants a les del microscopi de fluorescència, les estructures marcades apareixen brillants contrastant amb un fons negre. Aplicacions: 1. Ciència forense per anàlisi d'ADN i drogues 2. Estudis biològics 3. Analitzar àcids nucleics.

Microscòpia de camp obscur

La característica principal d'aquest microscopi és que la mostra és blanca i brillant i el fons és obscur (negre). Per aconseguir aquesta finalitat: S'ha de bloquejar la part central del raig de llum que passa a través d'un filtre, i que es col·loca sota del condensador. D'aquesta manera els rajos només passen per la vora. Amb aquest dispositiu es forma un con de llum (que el centre és obscur) que incideix lateralment sobre la mostra i només els rajos que són difractats o reflexats per les estructures penetren en la lent objectiu i la cèl·lula apareix com un objecte lluminós sobre fons obscur. Posa de manifest: la forma, la mida i el moviment de les cèl·lules. Aplicacions: 1. Estudi de microorganismes aquàtics i cèl·lules en cultiu 2. Observació de cèl·lules mòbils 3. Estudis de processos fisiològics com: mitosi i migració cel·lular.

Microscòpia de contrast de fases

Consisteix en il·luminar la mostra amb un con buit de llum. Per fer-ho s'utilitza un filtre en forma d'anell que disminueix la intensitat de la llum i al mateix temps provoca un retràs o desfase de la longitud d'ona (λ) – normalment ¼ de λ, de manera que és més curta. Aquest mètode indueix variacions subtils en l'índex de refracció, de les mostres translúcides, permetent així poder visualitzar una riquesa de detalls molt fins en l'estructura, els quals no es podrien veure amb el microscopi òptic. Per convertir un microscopi convencional amb un de contrast de fases, es substitueix el condensador i l'objectiu pels de contrast de fases: que contenen un filtre en anell i una placa de fases respectivament. Posa de manifest: la forma, la mida i el moviment de les cèl·lules. Aplicacions: 1. Observació de cèl·lules i teixits vius 2. Observació de la divisió cel·lular 3. Estudis de: fisiologia, parasitologia, farmacologia 4. Estudis geològics: minerals 5. Anàlisi de materials industrials: metalls, plàstics.

Microscòpia de fluorescència

Aquest microscopi és semblant a la microscopi òptic però que fa ús de la propietat de la fluorescència. Els fluorocroms són molècules que emeten fluorescència quan incideix una llum d'una longitud d'ona curta. Quan apliquem llum UV provinent d'un bombeta de mercuri, es produeix l'excitació del fluorocrom, i quan retorna a l'estat fonamental, la llum que emet es troba dins de la franja del visible (de 400-700 nm). A la taula hi ha cada fluorocrom amb la λ excitació (que surt de la llum UV una vegada filtrada) i la λ d'emissió (el que veurem als oculars o a la pantalla). Esquema bàsic de la il·luminació en el microscopi de fluorescència: La llum UV o visible surt de la bombeta, Passa pel filtre d'excitació que només deixa passar la llum blava que tenen una λ=450-490 nm, Després va a un mirall dicroic que reflexa la llum i passa per l'objectiu i va a la mostra, Aquesta llum, al incidir al fluorocrom es produeix una excitació i quan torna a l'estat fonamental la λ és de 520-560 nm, que correspon al color verd, La llum verda puja cap a l'objectiu i travessa el mirall dicroic (si λ>510 nm no hi ha reflexió de la llum, sinó que travessa el mirall dicroic), A continuació travessa el segon filtre de barrera que només deixa passar llum de 520-560 nm. Els microscopis de fluorescència que tenen als laboratoris clínics o d'anatomia patològica disposen d'un disc giratori on hi ha acoblats 3 filtres. Els filtres són de color blau, verd o vermell. En funció de l'estructura de la cèl·lula que es vulgui observar es posarà el filtre apropiat. Es poden fer combinacions de les imatges. Micrografies de cèl·lules en divisió, amb un microscopi de fluorescència. S'han usat 3 fluorocromos: DAPI (emet llum blava) per marcar cromosomes, GFP (emet llum verda) proteïna verda fluorescent, per marcar part intracel·lular cèl·lula, Rodamina (emet llum vermella) para marcar microtúbuls. Immunofluorescència: La immunofluorescència és una tècnica molt usada en la secció d'immunologia del laboratori clínic. S'usa per la detecció de malalties autoimmunes. És una tècnica molt específica ja que es busca la reacció Ag-Ac lligat a una fluorocrom.

MÈTODE DIRECTE: 1. Es col·loca la mostra (sèrum) 2. S'incuba (es deixa actuar un temps) amb la immunoglobulina específica (Ac) marcada amb un fluorocrom 3. Es fa un rentat 4. Observació al microscopi de fluorescència a 400X - Si hi ha fluorescència indica que a la mostra hi ha l'antigen - Si NO hi ha fluorescència indica que a la mostra NO hi ha l'antigen.

MÈTODE INDIRECTE: 1. Es fa una dilució (1/40) de la mostra (sèrum) 2. S'incuba la mostra (sèrum) en el portaobjectes que té fixat l'antigen 3. Es fa un rentat PBS 4. S'afegeix la immunoglobulina-antiglobulina humana (Ac) marcada amb un fluorocrom 5. S'elimina l'excés de fent un rentat PBS 6. Fer muntatge preparació 7. Observació al microscopi de fluorescència a 400X - Si hi ha fluorescència indica que a la mostra hi ha l'Anticòs (el pacient fabrica anticossos contra l'antigen, té la malaltia autoimmune) - Si NO hi ha fluorescència indica que a la mostra NO hi ha l'anticòs (no té la malaltia autoimmune).

Aplicacions Al laboratori clínic de l'Hospital Santa Caterina usen el microscopi de fluorescència per la detecció de malalties autoimmunes com: dermatomiositis, lupus. Fan el mètode immunofluorescència indirecte (IFI). Es busquen dues coses: 1) Fluorescència per la detecció de la malaltia 2) Fluorescència per veure a quins òrgans està afectant la malaltia.

Usen uns portaobjectes on hi ha tres teixits (fetge, ronyó i estómac) i es busca si presenta fluorescència alguns d'aquests teixits. En el cas que n'hi hagi, indica que la malaltia autoimmune del pacient està afectant aquest tipus de teixit 1. Marcatge de cèl·lules i teixits per la seva identificació i estudi de característiques 2. Estudi de cèl·lules normals i patològiques 3. Anàlisi laboratori clínic: detecció malalties autoimmunes (cèl·lules Hep-2) 4. Anàlisi laboratori anatomia patològica: detecció càncer de mama (gen Her-2).

Microscòpia confocal

Va ser inventat el 1955 per Marvin Minsky a l'estudiar neurones. El microscopi confocal està basat en la microscòpia de fluorescència. S'usa la llum làser que està més concentrada (no es dispersa tant). Normalment les mostres són molt fines, però poden tenir cert gruix. La mostra es van escanejant en els 3 eixos (x, y i z) i llavors es fan reconstruccions en 3D de cèl·lules i teixits. Funcionament del microscopi 1) La llum làser de color blau surt i passa per forat confocal. 2) Es dirigeix a un mirall dicroic, el travessa i va cap a la mostra. 3) En la mostra hi ha fluorocroms que són excitats i la llum que s'obté quan torna a l'estat fonamental és de color verd. 4) Per obtenir la informació de la mostra, el làser ha de ser desplaçat per tota la mostra, en els plans x, y i z, procés anomenat d'escaneig o escombrat. 5) La fluorescència és recollida per l'objectiu i dirigida a un mirall dicroic que la reflexa i la dirigeix a un detector, que només deixa passar la llum enfocada, de manera que la imatge serà ben nítida. 6) Amb programes de computació es reconstrueix la imatge obtinguda en 3D. TÈCNIQUES D'ESCOMBRATGE DE SONDA: - Estan formats bàsicament per una plataforma i una sonda o agulla fina que recorre la superfície de la mostra amb una gran precisió, fent un escaneig o escombrat. - La sonda es col·loca molt a prop de la mostra que es vol observar, a 1mm, generant una corrent elèctrica i es desplaça per la superfície, captant els electrons que s'escapen en el que s'anomena efecte túnel. - Els electrons salten de la sonda a la mostra i viceversa. - El sistema informàtic rep aquesta informació i genera una imatge en 3D, que reprodueix el relleu de la mostra amb una alta resolució. Depenent del tipus de sonda que s'utilitzi es pot obtenir informació sobre les propietats.

Existeixen dos tipus de microscopis d'escombratge de sonda: - Microscopi d'efecte túnel El microscopi d'efecte túnel és el prototip inicial d'escombratge de sonda. Té l'inconvenient que només pot fer-se servir amb materials conductors o semiconductors. - Microscopi de força atòmica La microscòpia de força atòmica és similar al d'efecte túnel, però es pot usar per tot tipus de materials (incloses les mostres biològiques). La sonda d'aquests microscopis és una agulla que es doblega al desplaçar-se sobre la mostra, detectant totes les irregularitats que hi ha en la seva superfície. Es captura la informació provinent de la força magnètica de la superfície de la mostra. S'aconsegueix veure molècules molt petites i àtoms.