Microscopía Confocal: Imágenes 3D de Alta Resolución y Contraste

La microscopía confocal es una técnica avanzada para el estudio tridimensional de muestras gruesas. Produce seccionamiento óptico de muestras (NO CORTA LAS MUESTRAS). Se utiliza como fuente de energía óptica los láseres, ya que tienen mayor poder de penetración en las muestras.

¿Qué es la Confocalidad?

• Secciona ópticamente, no corta la muestra.
• Localiza la parte importante en la estructura 3D: depende de la abertura del pinhole (que es un diafragma) que permite solo el paso de luz del plano enfocado.

Comparación: Confocal vs. Epifluorescencia

Microscopía Confocal

Detecta solo la fluorescencia del plano enfocado. Tiene mayor resolución y contraste de imágenes: la imagen es de un elevado contraste y se logra una mayor resolución al bloquear la fluorescencia fuera del plano enfocado en la muestra.

Microscopía Epifluorescencia

Detecta toda la fluorescencia, no discrimina. La imagen es de muy baja resolución y poco contraste por interferencia de la fluorescencia proveniente de los planos no enfocados superiores e inferiores.

¿Cómo Funciona un Microscopio Confocal?

• Fuente de iluminación de gran intensidad.
• Fuente de luz puntual (escaneo punto a punto).
• Longitud de onda única.
• Poder de penetración en la muestra.
• Hay mínimo 3 láseres en cada equipo (488nm, 543nm y 633nm).
• Las imágenes se ven en un computador, no se pueden ver al ojo.

Componentes Clave: Láseres y Fotomultiplicadores

Los láseres son una fuente puntual y única, por lo que en el combinador debe haber muchos láseres, y los más comunes son el 3 y 4.

Tiene un fotomultiplicador que amplifica la señal, detecta la luz en un punto, y debe ser muy sensible y además debe producir poco ruido (luz que no sirve).

Características de los Fotomultiplicadores:

• Altamente sensibles a los fotones de luz.
• Gran nivel de ganancia de amplificación de la señal.
• Producen muy poco ruido de fondo inherente.
• Amplifican la señal de 1 fotón en hasta 100 millones de veces.
• Detectores de luz puntual.

Obtención de la Imagen

¿Cómo se obtiene la imagen? Se excita punto a punto, la imagen no se puede proyectar y la imagen no es real.

Características Adicionales y Beneficios

• Tiene un plan apocromático.
• Visualización simultánea de 2 o más fluorocromos.
• Capacidad de trabajar con muestras vivas.
• Control en la intensidad de los láseres gracias a la AOTF (que prende o apaga los láseres).
• Seccionamiento óptico de especímenes gruesos (característica más importante).
• Reconstrucción 3D de los especímenes estudiados.

¿Qué se gana con esta técnica? El mejoramiento del contraste y la definición de las imágenes (mejoramiento de la razón señal/ruido) = Resolución.

Desventajas de la Microscopía Confocal

• Láser con vida útil variable.
• Número limitado de líneas láser.
• No todos los fluorocromos pueden ser excitados con los láseres estándar que trae el sistema.
• El barrido de la muestra pone limitaciones en la resolución temporal de procesos rápidos (msec).
• Photobleaching aún presente, pero en menor grado.
• Relativamente mucho más costosa.