Microbiología Clínica: Taxonomía, Pruebas Bioquímicas y Técnicas de Identificación

Taxonomía y Características Microbianas

Taxonomía: Clasificación y división de organismos en grupos o taxones específicos que comparten características morfológicas, fisiológicas y genéticas similares (género en mayúscula, especie en minúscula, en cursiva o subrayado).

Fenotipo: Rasgo observable (característica física, comportamiento).

Genotipo: Código genético de la célula de un organismo que determina sus características.

Ejemplo: 37 bacterias, 28 levaduras.

Hemólisis en Agar Sangre

Hemólisis: Observación en agar sangre.

1. α-hemólisis: Hemólisis parcial, color verdoso. Streptococcus pneumoniae (sensible a optoquina; otros estreptococos α-hemolíticos son resistentes).
2. β-hemólisis: Hemólisis total, halo transparente grande. Streptococcus pyogenes sensible a bacitracina; otros estreptococos β-hemolíticos son resistentes.
3. γ-hemólisis: No hemólisis, no hay cambio.

Pruebas de Sensibilidad y Diferenciación

Optoquina: Halo de inhibición >14mm (disco de 6mm), >16mm (disco de 10mm) realizar prueba completa de identificación (solubilidad en bilis).

Bacitracina: Cualquier zona de inhibición (+).

Solubilidad en Bilis: Diferencia S. pneumoniae de otros Streptococcus. Tiene enzima autolítica intracelular (amidasa); si se añade sal biliar, se activa la enzima y se produce autólisis. (+) Desaparición de la colonia; (-) Turbio.

Pruebas de Tipificación Bioquímica

Los microorganismos tienen su propio metabolismo (anabolismo: síntesis; catabolismo: degradación). Estas reacciones están determinadas por enzimas cuyas acciones se utilizan para el diagnóstico de microorganismos según sus características.

Se investiga:

1. Sembrando el microorganismo en un medio que contiene el sustrato y posterior incubación y observación del crecimiento/color.
2. Cultivando el microorganismo en un medio sin sustrato y enfrentándolo posteriormente para ver la reacción.

Normas Básicas para Pruebas Bioquímicas

1. Cultivo puro (la contaminación falsea la prueba).
2. Cultivo joven (18-24h) (las propiedades enzimáticas se pierden con el tiempo y aparecen otras que interfieren).
3. El número y tipo de pruebas depende de la sospecha diagnóstica.
4. La identificación se basa en el conjunto de características que se comparan con los de un grupo de microorganismos conocido; a mayor número de pruebas, mayor probabilidad de identificación.

SEIMC (Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica)

Sociedad científica sin ánimo de lucro que agrupa a profesionales del campo de la patología clínica, desde el punto de vista clínico y tratamiento hasta el diagnóstico microbiológico y prevención. Elabora documentos científicos, tratamientos antibióticos, organiza congresos, eventos y formación.

Longitud de Onda y Densidad Óptica (OD)

El crecimiento bacteriano en espectrofotómetro se mide a 600nm. La densidad óptica indicada de un cultivo sano es 0.5 a máximo 1. Se busca inocular poco y que llegue a 0.5; no vale inocular 0.5 directo porque podrían estar todos muertos. A 0.5 se encuentra en crecimiento exponencial; si es mayor, puede estar en fase estacionaria.

Metabolismo: Fermentación y Oxidación

Fermentación: Proceso anaeróbico efectuado por microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos.

Oxidación: Proceso aeróbico efectuado por aerobios estrictos.

• Fermentación: Produce ácido aeróbica y anaeróbicamente; puede producir gas, mayor acidez y el último aceptor de electrones es un sustrato orgánico.
• Oxidación: Produce ácido aeróbicamente, no gas, menor acidez, el último aceptor de electrones es el oxígeno.

API20E

Identificación de enterobacterias o bacilos Gram negativos. Consta de 20 microtubos (cúpula y tubo). La prueba de oxidasa no se realiza en la tira API. Se llenan todos los pocillos hasta la base de la cúpula. VP, GEL, CIT (cuadro) se llenan completamente. Cubrir con parafina (línea) ADH, LDC, ODC, URE, H2S (condiciones anóxicas). Si no se obtienen al menos 3 pruebas positivas, incubar 24h+ por si se debe a falta de crecimiento. Revelado de pruebas: TDA (añadir gota de FeCl3 3%), VP (gota de reactivo 1,2), IND (gota de reactivo Kovacs). Se ordenan en tripletes con números 1, 2, 4. Se suman los valores positivos por triplete (0-7). Obtenemos un número de 7 dígitos que indica la especie bacteriana y la calidad de la determinación.

Procedimientos Complementarios Fenotípicos

Cepas con escasa descripción del genotipo, genotipo atípico, baja frecuencia de aislamiento, difícil identificación fenotípica, crecimiento lento, difícil cultivo, nuevos patógenos. Los métodos moleculares no son útiles para identificar bacterias si la infección no es monobacteriana (+1 bacteria implicada).

MALDITOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight)

Tipo de espectrometría de masas, técnica de análisis de la composición de diferentes tipos de muestras. Ioniza las moléculas que componen la muestra y las separa en función de su masa. MALDI se basa en la obtención de un perfil de proteínas de la bacteria a identificar para su posterior comparación en la base de datos, proteinograma característico de cada especie bacteriana.

Proteómica: Es el estudio y caracterización del conjunto de proteínas expresadas por un genoma (proteoma). Cada especie bacteriana tiene un perfil proteico característico que ayuda a su identificación.

Ventajas de MALDI-TOF

• Alta tasa de identificación.
• Resultado fiable en minutos.
• No requiere identificación presuntiva.
• Técnica sencilla y fiable.
• Bajo coste de reactivos y bajas condiciones variables.
• Calibración y control de calidad frecuente y completo.

Procedimiento MALDI-TOF

1. Calibración.
2. Tratamiento previo del microorganismo.
3. Transferencia de la muestra a la tarjeta metálica.
4. Adición de matriz orgánica.
5. Análisis.

Componentes del Espectrómetro de Masas

1. Fuente de ionización (luz láser): Ioniza la muestra a analizar.
2. Analizador de masas: Acelera los iones y los separa en función de su masa/carga utilizando campos eléctricos/magnéticos.
3. Detector: Se produce una señal eléctrica por la llegada de iones al detector, la cual es procesada, ampliada y enviada a un ordenador que elabora el espectro de masas a partir de las señales.

Se puede hacer análisis de células intactas (fiable y el medio no influye; se debe tener en cuenta la antigüedad, ya que +24h los productos metabólicos pueden interferir), o análisis después de la extracción de proteínas (cuando el otro no es fiable).

Genes de Interés en Microbiología

rrs, ITS, ARNr 23s, rpoB, gyrB