Microbiología Clínica: Medios de Cultivo, Tinciones y Pruebas de Identificación Bacteriana

Tipos de Medios de Cultivo

1. Medios Enriquecidos

Contienen nutrientes adicionales que favorecen el crecimiento de microorganismos exigentes.

• Agar sangre: Medio enriquecido básico para observar hemólisis.
• Agar chocolate: No es reproducible de forma exacta porque la composición de la sangre varía; se considera un medio no sintético.

2. Medios Selectivos

Permiten el aislamiento de un cultivo bacteriano específico inhibiendo otros.

• Agar MacConkey: Contiene sales biliares que permiten el crecimiento de bacilos Gram negativos (BGNEG) y enterobacterias, mientras que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas (BGPOS).
• Agar Sabouraud: Exclusivo para hongos; contiene cloranfenicol que inhibe el crecimiento de bacterias.

3. Medios Diferenciales

Utilizan indicadores para diferenciar entre distintos microorganismos según sus propiedades metabólicas.

• Agar MacConkey: Las bacterias lactosa positivo producen un color rosa por el cambio de pH. Si las colonias son amarillas o beige, son lactosa negativo (no fermentan la lactosa y sube el pH).
• Caldo tioglicolato: Permite separar bacterias aerobias y anaerobias según su posición en el tubo.
• Agar sangre: Mide la capacidad hemolítica de las bacterias:
  • ALFA: Hemólisis parcial (coloración verde).
  • BETA: Hemólisis total (coloración blanca/transparente alrededor de la colonia).
  • GAMMA: Ausencia de hemólisis (el medio permanece igual).

Sistemas de Transporte de Muestras

• Jeringa montada: Se eliminan las burbujas de aire y se introduce la punta de la aguja en un tapón de goma estéril para mantener la anaerobiosis.
• Hisopo: Utiliza un tubo que contiene un medio semisólido reducido y esterilizado.
• Recipientes cerrados con atmósfera anaerobia: Proporcionan una atmósfera de CO₂, N₂ y libre de oxígeno; son de un solo uso.

Técnicas de Sembrado y Cultivos

• Agotamiento por estría en placa (asa de siembra): Utilizado comúnmente en Agar sangre y Agar chocolate.
• Siembra en superficie, césped o extensión: Técnica habitual para Agar MacConkey y Agar Sabouraud.

Procedimiento de la Tinción de Gram

1. Cristal violeta (2 minutos): Colorante primario que marca todas las bacterias uniéndose al peptidoglicano.
2. Lugol (1 minuto): Actúa como mordiente para fijar el colorante.
3. Alcohol/Acetona (30 segundos): Agente decolorante que elimina el cristal violeta en las bacterias Gram negativas.
4. Safranina (1 minuto): Colorante de contraste que tiñe de rojo o rosa a las bacterias Gram negativas.

Esquema de Elección para la Identificación Bacteriana

Tras realizar la Tinción de Gram, se sigue el siguiente algoritmo:

A. Cocos Gram positivos

Se realiza la prueba de la CATALASA:

1. Catalasa positivo: Género Staphylococcus. Se procede a la AGLUTINACIÓN:
   • Aglutinados: Staphylococcus aureus.
   • No aglutinados: S. saprophyticus o S. epidermidis (se diferencia mediante API Staph).
2. Catalasa negativo: Género Streptococcus. Se observa la HEMÓLISIS:
   • Hemólisis alfa: Prueba de la OPTOQUINA:
     • Resistente: S. viridans.
     • Sensible: S. pneumoniae.
   • Hemólisis beta/gamma: Prueba de la BACITRACINA:
     • Resistente: Se realiza la prueba de BILIS ESCULINA:
       • Negativo: Streptococcus de los Grupos B, C, E, F.
       • Positivo: Streptococcus Grupo D (ej. Enterococcus faecalis).
     • Sensible: Streptococcus Grupo A.

B. Bacilos Gram negativos

Se realizan cultivos en medios diferenciales y selectivos, seguidos de la galería API E20.

• Lactosa positivo (Lac+): Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae.
• Lactosa negativo (Lac-): Serratia marcescens, Proteus mirabilis.

Pruebas Bioquímicas y de Identificación

• Catalasa: Detecta la enzima catalasa al producir burbujas (liberación de oxígeno) al contacto con peróxido de hidrógeno.
• Aglutinación: Detecta la unión de la fracción Fc de la IgG al factor de coagulación del fibrinógeno.
• API Staph y API E20: Sistemas de identificación estandarizados mediante pruebas bioquímicas miniaturizadas.
• Antibiograma (Difusión en disco): Se utiliza un disco impregnado con antibiótico para medir el diámetro del halo de inhibición bacteriana.
• Bilis esculina: Siembra por aguja; la hidrólisis de la esculina en presencia de citrato férrico (indicador) produce esculetina, que torna el medio de color negro.

Interpretación de la Sensibilidad a Antibióticos

• Sensible: La infección puede tratarse con las dosis recomendadas del fármaco.
• Intermedio: Requiere dosis altas pero alcanzables sin riesgos de toxicidad para el paciente.
• Resistente: El microorganismo no se inhibe a la concentración terapéutica habitual.

En el antibiograma, el diámetro del halo de inhibición (en mm) es inversamente proporcional a la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI).

Esterilización y Detección de Esporas

Para la visualización de esporas se utiliza la tinción de verde malaquita (tiñe las esporas) y safranina como tinte de contraste (tiñe las formas vegetativas de las bacterias).

• Escherichia coli: No produce esporas; crece a temperatura ambiente.
• Bacillus: Capaz de producir esporas; crece a temperatura ambiente y resiste hasta 85ºC, pero no sobrevive al autoclave (condiciones estándar: 121ºC, 1 atm de sobrepresión, durante 20 minutos).