Métodos de Preparación y Estandarización de Inóculos: Técnicas de Recuento Microbiano

Preparación y Estandarización de Inóculos

Cuando las muestras son muy viscosas o concentradas, es necesario estandarizar el inóculo de siembra para obtener resultados fiables.

Técnica General para la Preparación de Inóculos

Los inóculos se obtienen a partir de un cultivo joven y puro. El procedimiento general es el siguiente:

1. Se toma con asa estéril varias colonias de un cultivo o porción de muestra biológica.
2. Se suspenden en 5 ml de diluyente.
3. Se homogeneizará la suspensión.

Diluyentes Utilizados

Como diluyentes se pueden usar:

• Caldo de cultivo: Es un medio base, sin agar.
• Solución salina estéril: Suele ser el más adecuado.
• Agua destilada estéril.

Estandarización de un Inóculo

Escala de Turbidez: Técnica de Kirby-Bauer

Esta técnica utiliza escalas con un gradiente de turbidez. Cada tubo de la escala va numerado y sirve como patrón de referencia, que se ajusta mediante:

• Comparación visual aproximada.
• Espectrofotometría.

La escala de McFarland está constituida por una serie de tubos donde se origina un precipitado blanco de sulfato bárico, por la reacción de ácido sulfúrico con cloruro de bario. La escala de McFarland relaciona la turbidez de los patrones con el número de microorganismos de la muestra.

Técnicas de Recuento Microbiano

Técnicas de Recuento Indirecto

Turbidez

En un cultivo puro o axénico, todas las células son más o menos del mismo tamaño, por lo que su número será proporcional a la turbidez. Cuanto mayor masa de células microbianas tenga el cultivo, mayor será su turbidez y menos luz se transmitirá.

Peso Seco

En un cultivo axénico, todas las células tienen aproximadamente el mismo peso. Por lo tanto, se puede medir su número de células dividiendo el peso seco del cultivo por el peso seco de una célula individual.

Actividad Metabólica

Conjunto de técnicas indirectas que proporcionan un recuento de viables. Se basa en que los microorganismos vivos forman productos metabólicos.

Técnicas de Recuento Directo

Recuento Directo Visual

Se realiza con un microscopio y un portaobjetos llamado cámara de recuento. Las más utilizadas son la de Petroff-Hausser y la de Neubauer, pero todas tienen marcados unos cuadros de dimensiones y profundidad conocidas.

El portaobjetos tiene en el centro una rejilla con 25 cuadros, un área total de 1 mm² y un volumen de 0,02 mm³.

Recuento en Placa (UFC)

Consiste en diluir una muestra de cultivo de manera seriada y luego sembrar. Después, la placa se incuba y, cuando se han formado colonias visibles, se seleccionan las placas que tengan entre 30 y 300 colonias.

La fórmula para calcular las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) es:

UFC / ml = (Nº de colonias × Factor de Dilución) / Volumen sembrado (ml)

Número Más Probable (NMP)

Este método proporciona un recuento de viables. El NMP requiere realizar varias series de diluciones decimales de la muestra del cultivo, pero no en un diluyente, sino directamente en un medio de cultivo líquido adecuado para el crecimiento de microorganismos.

Filtración

Tipos de filtros utilizados en esta técnica:

• Filtros profundos o de profundidad.
• Membranas filtrantes.
• Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo).