Métodos de Laboratorio para Proteínas: Cromatografía y Cuantificación Bradford

Cromatografía

Obtención del Extracto Crudo

• Tome varias colonias de una placa con E. coli HB101 + pFluoroGreen o pFluoroBlue.
• Resuspenda en 1 ml de solución salina en un tubo Eppendorf.
• Centrifugue el tubo Eppendorf a 10,000 rpm por 5 minutos.
• Resuspenda las células en 150 µl de tampón de lisis A con Vortex si es necesario, evitando que queden grumos.
• Incube 20 minutos a 37 °C.
• Deje a -20 °C por 15 minutos.
• Añada 150 µl de tampón de lisis B y mezcle brevemente con Vortex.
• Incube a temperatura ambiente por 10 minutos.
• Centrifugue a 10,000 rpm por 10 minutos para descartar los restos celulares.

Fraccionamiento del Extracto Crudo

1. Rotule cinco tubos Eppendorf con los números 1-5.
2. Cargue la columna lentamente con 200 µl del extracto de proteína GFP o BFP. Deje que el extracto entre completamente en la columna.
3. Eluya la columna con 3 ml de tampón de elución:
   • Añada el tampón lentamente, dejando caer gotas continuamente.
   • Evite su acumulación (para no diluir la muestra).
   • No deje que la columna se seque.
4. Recolecte fracciones de 0,5 ml en los tubos, guiándose por las marcas en la pared del tubo.
5. Observe las fracciones con luz UV para identificar los tubos que contienen la proteína fluorescente.
6. Anote todas sus observaciones.

Cuantificación de Proteínas por Espectroscopia de Absorción: Método de Bradford

I. Extracción de Albúminas de Semillas

• Coloque 3-5 semillas (arveja, garbanzo, haba, lenteja, poroto) en un mortero (2 por mesón) y muélalas hasta obtener una pasta homogénea. Mantenga en hielo.
• Pese 0,1 g de esta pasta en un tubo Eppendorf y agregue 1 ml de solución de extracción. Agite por 1 minuto y deje reposar en hielo por 3 minutos.
• Repita esta operación dos veces más.
• Luego, centrifugue a 10,000 rpm por 10 minutos a 4 ºC. El sobrenadante contiene la fracción de albúminas. Guarde las fracciones obtenidas para el práctico 3 (electroforesis).

II. Determinación de la Concentración de Proteínas de la Fracción de Albúminas

• Prepare soluciones de concentración conocida de BSA según la tabla (1-3).
• Diluya las fracciones 1/20 (250 µl de fracción en 4,75 ml de tampón de extracción).
• Mida la absorbancia de estas soluciones y de las fracciones de albúminas diluidas. Blanco para la curva: agua más reactivo de Bradford; blanco para las fracciones: solución de extracción más reactivo de Bradford.
• Haga una curva estándar con estas soluciones según la tabla (1-3).
• Determine la concentración de las fracciones.

Método 1: Ensayo en Cubetas

1. Coloque en una gradilla nueve tubos de ensayo y nueve tubos Eppendorf y rotúlelos.
2. Prepare un conjunto de nueve soluciones estándar (1 ml) en el rango de 0 a 0,9 mg/ml a partir de una solución stock de BSA de 1 mg/ml en los tubos de ensayo.
3. Pipetee 100 µl de cada solución en un tubo de ensayo correspondiente.
4. Agregue 5 ml de reactivo de Bradford diluido y mezcle inmediatamente.
5. Espere al menos 5 minutos para que se desarrolle el color, y lea en el espectrofotómetro a 595 nm (en duplicado).
6. Diluya las fracciones de albúmina obtenidas en el procedimiento I (1/20: 100 µl de fracción en 1,9 ml de tampón de extracción).
7. Proceda como en los pasos 3 a 5.
8. Grafique la concentración de proteína vs. absorbancia para la curva estándar. Obtenga la recta ajustada a sus datos, la cual se utilizará para interpolar el valor de la concentración de las muestras de albúmina.