Métodos de Laboratorio para Caracterizar Bacterias: Pruebas Bioquímicas Clave

Pruebas Bioquímicas Esenciales para la Identificación Bacteriana

Las pruebas bioquímicas son herramientas fundamentales en microbiología para la identificación y caracterización de bacterias. Permiten observar la capacidad metabólica de los microorganismos, como la producción de enzimas específicas, la fermentación de azúcares o la utilización de ciertos sustratos. A continuación, se detallan algunas de las pruebas más comunes utilizadas en el laboratorio.

Prueba de Catalasa

Principio

Consiste en añadir peróxido de hidrógeno a una colonia bacteriana y observar si se forman burbujas. Esta prueba detecta la presencia de la enzima catalasa, que descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

Reactivo

• Solución de peróxido de hidrógeno (H₂O₂).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 5-20 segundos.
• Temperatura de incubación: Ambiente (TA).

Resultados

• Burbujas (+): Presencia de catalasa.
• No burbujas (-): Ausencia de catalasa.

Prueba de Oxidasa

Principio

Se pone una colonia bacteriana en contacto con fenilendiamina para determinar si sintetiza la enzima citocromo oxidasa. La presencia de esta enzima se manifiesta por un cambio de color.

Reactivo

• Fenilendiamina (reactivo de Kovacs o de Gaby y Hadley), que forma indofenol.

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de reacción: 10-30 segundos.
• Temperatura de incubación: Ambiente (TA).

Resultados

• Zona de reacción color azul-violeta/azulado (+): Presencia de oxidasa.
• Color rosado o sin cambio de color (-): Ausencia de oxidasa.

Prueba de Oxidación-Fermentación (Hugh-Leifson)

Principio

Permite identificar si la bacteria tiene un metabolismo oxidativo (aerobio), fermentativo (anaerobio facultativo) o ambos, utilizando glucosa en un medio semisólido con bajo contenido de peptona y un indicador de pH.

Reactivo

• Vaselina o aceite de parafina estéril (para crear condiciones anaerobias en uno de los tubos).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 24-48 horas.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Tubo sin cubrir amarillo y tubo cubierto verde: Solo oxidación (bacteria aerobia estricta).
• Ambos tubos amarillos: Oxidación y fermentación (bacteria aerobia facultativa).
• Tubo sin cubrir verde y tubo cubierto amarillo: Solo fermentación (bacteria anaerobia estricta).

Prueba ONPG (Orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido)

Principio

Determina si la bacteria es capaz de fermentar lactosa, específicamente si posee la enzima β-galactosidasa, que hidroliza el ONPG, liberando un compuesto de color amarillo.

Reactivo

• Orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 4 horas.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Medio color amarillo: β-galactosidasa (+).
• Medio incoloro o amarillo pálido: β-galactosidasa (-). (Si es negativo, se recomienda incubar 24 horas y repetir la lectura).

Prueba de Voges-Proskauer (VP)

Principio

Determina la capacidad de la bacteria para fermentar la glucosa por la vía butanodiólica, produciendo acetoína (acetilmetilcarbinol), que reacciona con los reactivos para dar un color rosado.

Reactivo

• Alfa-naftol y KOH al 40% (reactivos de Barritt).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 24-48 horas.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Medio color rosado: (+) acetoína (fermentación de glucosa por vía butanodiólica).
• Medio color amarillo: (-) acetoína.

Prueba de Rojo de Metilo (RM)

Principio

Determina la capacidad de la bacteria de fermentar glucosa por la vía del ácido mixto, produciendo y acumulando ácidos estables que disminuyen el pH del medio por debajo de 4.4.

Reactivo

• Rojo de Metilo (indicador de pH).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 24-48 horas.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Medio color rojizo: (+) fermentación de glucosa por vía del ácido mixto (pH ≤ 4.4).
• Medio color amarillo: (-) fermentación de glucosa por vía del ácido mixto (pH > 4.4).

Prueba de Fermentación de Azúcares

Principio

Detecta la producción de ácido y, en algunos casos, la producción de gas, a partir de la fermentación de azúcares específicos (glucosa, lactosa, sacarosa, etc.) en un medio de cultivo con un indicador de pH y una campana de Durham.

Reactivo

• Medio de cultivo para fermentación de azúcares (con indicador de pH y campana de Durham).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 24 horas.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Medio amarillo y gas en campana Durham: (+) con formación de gas.
• Medio amarillo y sin gas en campana Durham: (+) sin formación de gas.
• Medio violeta: (-).

Agar Hierro Kligler (KIA)

Principio

Se utiliza para la diferenciación de enterobacterias basándose en su capacidad para fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico (H₂S) y gas.

Reactivo

• Agar Hierro Kligler (contiene glucosa, lactosa, peptona, indicador rojo de fenol y tiosulfato de sodio).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 24 horas.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Pico rojo / Fondo amarillo: La bacteria fermenta solo glucosa.
• Pico y fondo amarillo: La bacteria fermenta glucosa y lactosa.
• Pico y fondo rojo: La bacteria no fermenta azúcares.
• Presencia de burbujas o rotura del agar: La bacteria produce gas.
• Ennegrecimiento del medio: La bacteria produce ácido sulfhídrico (H₂S).

Triple Sugar Iron (TSI)

Principio

Similar al KIA, se utiliza para la diferenciación de enterobacterias, evaluando la fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa, así como la producción de H₂S y gas.

Reactivo

• Agar Triple Sugar Iron (contiene glucosa, lactosa, sacarosa, peptona, indicador rojo de fenol y tiosulfato de sodio).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 24 horas.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Pico rojo / Fondo amarillo: La bacteria fermenta solo glucosa.
• Pico y fondo amarillo: La bacteria fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
• Pico y fondo rojo: La bacteria no fermenta azúcares.
• Presencia de burbujas o rotura del agar: La bacteria produce gas.
• Ennegrecimiento del medio: La bacteria produce ácido sulfhídrico (H₂S).

Prueba de Utilización de Citrato

Principio

Evalúa si una bacteria es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo. El crecimiento y la utilización del citrato alcalinizan el medio, cambiando el color del indicador.

Reactivo

• Agar Citrato de Simmons (con azul de bromotimol como indicador).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 24 horas.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Color azul intenso: Citrato (+).
• Sin cambio de color (permanece azul grisáceo): Citrato (-).

Prueba de Utilización de Malonato

Principio

Para evaluar si una bacteria es capaz de utilizar malonato de sodio como fuente de carbono. La utilización del malonato produce alcalinidad, cambiando el color del indicador.

Reactivo

• Caldo Malonato (con azul de bromotimol como indicador).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 24 horas.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Color azul: Malonato (+).
• Sin cambio de color (permanece verde): Malonato (-).

Prueba de Reducción de Nitratos

Principio

Permite identificar el tipo de respiración anaerobia que tienen las bacterias, específicamente si son capaces de reducir nitratos a nitritos o a nitrógeno gaseoso.

Reactivo

• Reactivos de Griess (ácido sulfanílico y alfa-naftilamina) y polvo de zinc.

Procedimiento y Condiciones

• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Coloración rojiza (después de añadir reactivos de Griess): Reducción de nitratos (+).
• Sin cambio de color (después de añadir reactivos de Griess): Reducción de nitratos (-). (Si después de añadir polvo de zinc el color es rosado o rojo, confirma la ausencia de reducción; si no hay cambio de color, indica desnitrificación a nitrógeno gaseoso).

Prueba de Hidrólisis del Hipurato

Principio

Sirve para la identificación de Campylobacter y también como técnica complementaria para la identificación de Legionella, Gardnerella y Actinobacillus. Detecta la presencia de la enzima hipuricasa, que hidroliza el hipurato de sodio.

Reactivo

• Ninhidrina (para detectar el producto de la hidrólisis).

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 2 horas + 30 minutos (para la adición de ninhidrina).
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Suspensión color violeta intenso: Hipuricasa (+).
• Suspensión sin cambio de color: Hipuricasa (-).

Prueba de Hidrólisis de Esculina

Principio

Identificación presuntiva de estreptococos del grupo D y Enterococcus. Detecta la capacidad de la bacteria para hidrolizar la esculina en presencia de bilis, formando un compuesto que reacciona con el hierro del medio, produciendo un ennegrecimiento.

Reactivo

• Agar Bilis Esculina.

Procedimiento y Condiciones

• Tiempo de incubación: 3 días.
• Temperatura de incubación: 35 ± 2ºC.

Resultados

• Oscurecimiento o ennegrecimiento del medio (+): Hidrólisis de esculina.
• Ausencia de oscurecimiento del medio de cultivo (-): No hidrólisis de esculina.