Métodos Inmunológicos Avanzados: DOT-ELISA y Western Blot para Detección de Antígenos y Anticuerpos

Técnicas Inmunológicas para la Identificación de Componentes Biológicos

7.1 DOT-ELISA o Método de las Manchas

Es un método sencillo que permite fijar una gran cantidad de proteínas a las membranas de nitrocelulosa. Se siembran sobre la membrana de nitrocelulosa unas gotas de la solución antigénica, de forma que el área de detección se limite a un área de un diámetro aproximado de 1 mm. Para detectar anticuerpos (Ac) en suero, se sigue el siguiente procedimiento:

1. Depositar sobre la membrana de nitrocelulosa una pequeña gota de antígeno (Ag) y dejar secar bajo una lámpara.
2. Bloquear la membrana con proteína irrelevante y realizar un lavado.
3. Sumergir la membrana en una solución de la muestra problema sospechosa de contener Ac. Incubar, eliminar la solución y lavar la membrana.
4. Sumergir la membrana en una solución de Ac marcado con enzima. Incubar, eliminar la solución y lavar la membrana.
5. Sumergir la membrana en una solución de sustrato que dé un producto final coloreado que precipite en la membrana sobre el lugar de reacción.
6. Recuperar la membrana y realizar la lectura. Si en la muestra había Ac, en la zona de siembra del Ag se observa una coloración.

7.2 Western Blot

Consiste en la combinación de tres técnicas analíticas:

• Separación mediante electroforesis de los componentes del Ag en geles de poliacrilamida.
• Electrotransferencia o electroblotting de los componentes del Ag desde los geles a membranas inmovilizantes.
• Identificación principalmente mediante enzimoinmunoensayos con anticuerpos (Ac) conocidos.

Esta técnica se desarrolla en seis pasos:

1. Solubilización del Antígeno (Ag)

Con este paso se consigue la ruptura del Ag en componentes polipeptídicos de distintos pesos moleculares que contienen los epítopos del Ag y los mantienen activos. Además, provoca un reparto uniforme de las cargas, lo que hace que, al someterlos a un campo eléctrico, migren únicamente en función del peso molecular de los péptidos.

2. Preparación de los Geles de Poliacrilamida

Estos geles están formados por monómeros de acrilamida y bisacrilamida.

3. Separación Electroforética del Ag en el Gel

Una vez preparado el gel, se realizarán unos pocillos y se aplicará la muestra. Se rellenará la cubeta de electroforesis con el tampón adecuado y se aplicará el campo eléctrico para que migren los distintos componentes del Ag.

4. Electrotransferencia del Ag a un Soporte de Membrana

Se suelen utilizar membranas de nitrocelulosa.

Procedimiento de Transferencia:

• En primer lugar, se mantiene el gel en un tampón durante unos 30 minutos.
• A continuación, se coloca todo el sistema en una cubeta con tampón en este orden: esponja, papel de filtro, gel, membrana, papel de filtro y esponja, y se deja pasar la corriente desde el polo negativo al positivo.
• Se suele incorporar al gel un control de la transferencia para comprobar que esta se ha realizado adecuadamente.
• Se introduce en la cubeta de electroforesis durante 1 hora a 100V, utilizando un refrigerante para evitar que la temperatura suba excesivamente.

5. Bloqueo de los Sitios de Unión de Proteínas Libres en la Membrana

6. Enzimoinmunoensayo o Radioinmunoensayo

Se utiliza para detectar Ac en muestras de suero problema o para identificar bandas antigénicas específicas con antisueros conocidos. Se suele emplear anti-IgG marcado con enzima para el revelado.