Métodos de Extracción de Ácidos Nucleicos: Fundamentos de la Lisis Celular y Optimización de Protocolos

Extracción de Ácidos Nucleicos

Partimos de la suspensión celular obtenida en el pretratamiento. El objetivo es conseguir una solución en la que los ácidos nucleicos se encuentren libres.

El proceso de extracción implica dos etapas fundamentales:

• La lisis celular para liberar los ácidos nucleicos.
• La inactivación de nucleasas celulares (ADNasa y ARNasa) para evitar la degradación.

Ambos procesos se consiguen mediante la incubación de la suspensión celular con una solución de lisis.

La Solución de Lisis

La composición de la solución de lisis depende del tipo de célula que se va a lisar. Puede incluir detergentes, EDTA, proteasas y agentes caotrópicos.

Detergentes

Los detergentes desestructuran la bicapa lipídica de las membranas y desnaturalizan las proteínas que hay en ellas. El detergente más utilizado es el dodecil-sulfato-sódico (SDS).

EDTA

El EDTA es un quelante de cationes divalentes como el calcio y el magnesio.

• El Mg²⁺ es fundamental para la actividad de muchas enzimas.

En consecuencia, al atrapar los cationes de magnesio que hay en el medio, el EDTA inhibe la actividad de las ADNasas.

Proteasas

Las proteasas realizan la digestión de las proteínas de la membrana celular, facilitando la rotura y disolución de las membranas y eliminando las nucleasas.

Agentes Caotrópicos

Son agentes que se encargan de inactivar las nucleasas. Desnaturalizan las macromoléculas impidiendo que realicen su actividad.

Tratamiento en Células con Pared Celular

La presencia de pared celular en bacterias, levaduras, hongos y células vegetales dificulta la lisis celular. Para degradar esta pared son necesarios otros procesos o tratamientos, como los tratamientos enzimáticos, tratamientos mecánicos o químicos (CTAB).

Tratamientos Específicos para la Pared Celular

Tratamiento Enzimático

Para degradar la pared se suelen emplear enzimas específicas que digieren los componentes de la pared:

• Lisozima: Degrada la pared de bacterias.
• Liticasa: Degrada la pared de las células vegetales, levaduras y hongos.

Tratamiento Mecánico

En este caso, la pared celular se rompe mediante procesos mecánicos:

• Sonicación.
• Ciclos de congelación-descongelación, etc.

Tratamiento Químico (CTAB)

Se utiliza una molécula denominada CTAB (bromuro de cetil-trimetilamonio), que facilita la eliminación de polisacáridos (abundantes en la pared celular) en el proceso de purificación.

Verificación del Resultado de la Lisis

Es importante asegurarse de que se ha conseguido una solución homogénea que indique que el proceso ha sido eficiente. Si la lisis celular no resulta suficiente, se debe prolongar el protocolo hasta conseguir una homogeneización completa.

*Nota: Una solución homogénea es aquella que no tiene grumos ni cuerpos celulares.

Consideraciones en la Extracción del ADN

Es importante eliminar el ARN de la muestra extraída porque puede interferir en estudios posteriores. Esto se logra mediante el:

• Uso de ARNasas: Incubar a 37ºC durante 15-45 minutos.