Métodos de Determinación y Automatización del Hemograma: Hemoglobina, Hematocrito y Principio Coulter

Determinación de Parámetros Hematológicos Fundamentales

Método de la Cianmetahemoglobina para la Concentración de Hemoglobina

El proceso para la determinación de la concentración de hemoglobina sigue los siguientes pasos:

1. La metahemoglobina pasa a cianmetahemoglobina en presencia de cianuro potásico.
2. Finalmente, se mide la densidad óptica en un espectrofotómetro a 540 nm, ya que la cianmetahemoglobina presenta un pico de absorción característico a esa longitud de onda.
3. La concentración de hemoglobina presente en la muestra se calcula interpolando el valor de densidad óptica obtenido en una curva de calibración realizada con patrones de hemoglobina de concentración conocida.

Hematocrito

Macrohematocrito (Método Wintrobe)

Para la realización del macrohematocrito se utilizan tubos especiales, denominados tubos de Wintrobe, que son muy finos y están graduados con una escala externa de 0 a 100 mm.

1. El procedimiento consiste en llenar el tubo de sangre anticoagulada con EDTA utilizando una pipeta Pasteur, hasta la marca 100.
2. Para ello, se introduce la punta de la pipeta hasta el fondo del tubo y se empieza a descargar la sangre.
3. A medida que el tubo se va llenando, la pipeta se eleva, manteniendo siempre la punta por debajo del nivel de la sangre.
4. De esta manera se evita la formación de burbujas y espuma en el interior del tubo.

Microhematocrito

Para la realización del microhematocrito se utilizan capilares específicos para esta determinación (normalmente de 75 mm), que se llenan directamente del tubo de sangre anticoagulada, colocándolos ligeramente inclinados en la boca del tubo.

• Los capilares no se llenan enteros, sino aproximadamente 3/4 de su longitud, evitando la presencia de burbujas de aire.
• A continuación, el capilar con la sangre se sella con plastilina por el extremo por el que se ha llenado y se centrifuga en una centrífuga para microhematocrito a 10.000-12.000 rpm durante cinco minutos.
• Estas centrífugas tienen un rotor especial plano, con ranuras para colocar los capilares y una banda elástica en la periferia. Los capilares se colocan en las ranuras con el extremo sellado en contacto con la banda periférica, lo que evitará su vaciamiento durante la centrifugación.

Lectura del Microhematocrito

La lectura se realiza midiendo directamente la columna de hematíes y la columna total de sangre (hematíes + plasma) con una regla graduada en milímetros y calculando el hematocrito en tanto por ciento mediante una regla de tres.

Para facilitar la lectura, existen lectores de hematocrito. Estos consisten en un soporte con una ranura donde encaja el capilar:

• El soporte tiene una línea vertical en el centro y una marca (normalmente un punto rojo) en un extremo.
• El capilar se coloca en la ranura con la parte de los hematíes apuntando a la marca roja y la interfase de separación entre hematíes y plasma coincidiendo con la línea vertical.

Fórmula Leucocitaria (Recuento Diferencial)

La fórmula leucocitaria se obtiene mediante estudio microscópico con el objetivo 100x de extensiones sanguíneas teñidas con May-Grünwald-Giemsa o con Wright.

Se cuentan 100 leucocitos y se calculan los porcentajes de cada uno de los tipos observados, incluyendo formas inmaduras y blastos. Adicionalmente:

• Se valoran cualitativamente los hematíes (respecto al tamaño, color y forma) y las plaquetas.
• Se informa de la presencia de eritroblastos y su porcentaje en relación con 100 leucocitos.

Automatización del Hemograma

Principios de Funcionamiento de los Contadores Hematológicos

Los contadores hematológicos modernos se basan en tres principios fundamentales:

• Medida de la Impedancia (Principio Coulter).
• Medida de la Dispersión Óptica.
• Citometría de Flujo con anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos.

Medida de la Variación de Impedancia: El Principio Coulter

La impedancia se define como la oposición que presenta un circuito eléctrico al paso de la corriente.

Para poder entender el Principio Coulter, supongamos dos cámaras llenas de una solución electrolítica y separadas por un orificio o un pequeño canal. En cada cámara se sumerge un electrodo y se establece una diferencia de potencial entre ambos, generando una corriente eléctrica continua que atraviesa el orificio.

Esto es debido a que la solución electrolítica tiene iones disueltos con carga que se desplazan en el campo eléctrico generado por los electrodos.

Cuando una partícula (célula sanguínea) atraviesa el orificio, lo obstruye parcialmente, impidiendo la libre circulación de los iones. Por lo tanto, aumenta transitoriamente la oposición o la resistencia al paso de la corriente eléctrica, es decir, se produce un aumento de la impedancia. Este pulso es proporcional al volumen de la partícula.