Métodos de Cuantificación en PCR en Tiempo Real: Absoluta y Relativa

Métodos de Cuantificación en PCR en Tiempo Real

1. Cuantificación Absoluta

La técnica de cuantificación absoluta relaciona la señal obtenida con la PCR en tiempo real al número de copias fijo de una secuencia estándar utilizando una curva de calibración. Las curvas de calibración son altamente reproducibles y permiten la generación de datos específicos y sensibles. Sin embargo, el modelo de curvas de calibración externas debe ser rigurosamente validado con absoluta exactitud, ya que la cuantificación de la expresión genética en la PCR en tiempo real depende exclusivamente de la precisión de los estándares empleados (Pfaffl, 2008).

Además, el diseño de secuencias estándar, su producción y la determinación exacta de sus concentraciones, así como su estabilidad a largo plazo y su almacenamiento, son factores complejos y pueden presentar algunos problemas (Pfaffl, 2004). Estas consideraciones hacen de la cuantificación absoluta un procedimiento laborioso, costoso y que no siempre es factible en todos los laboratorios.

2. Cuantificación Relativa

La cuantificación relativa no requiere estándares con concentraciones determinadas. Esta técnica se utiliza para obtener la magnitud de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión genética de un gen en estudio en comparación con uno o más genes de referencia (Pfaffl, 2004). Es importante considerar que la expresión de los genes de referencia debe ser constante en las células estudiadas. Por ello, las secuencias utilizadas para cuantificación relativa son generalmente genes "housekeeping" (Ambion, 2008).

Opciones de Cebadores para Síntesis de ADNc

A continuación, se presenta una tabla comparativa de las diferentes opciones de cebadores (primers) utilizados en la síntesis de ADNc, detallando su estructura, función, ventajas y desventajas.