Métodos Avanzados para la Separación y Obtención de Ácidos Nucleicos

Técnicas Fundamentales para la Separación y Purificación de Ácidos Nucleicos

Precipitación con Sales (Salting-Out)

Las proteínas se precipitan al enfrentarlas a altas concentraciones de sales que aumentan la fuerza iónica del medio. Esto refuerza las interacciones hidrófobas entre proteínas, reduciendo su solubilidad y provocando su precipitación.

Protocolo de Precipitación de Proteínas y ADN

1. Precipitación de proteínas: Añadir volumen igual de solución salina al lisado de proteínas (utilizar vórtex). Centrifugar.
   • Sobrenadante: Contiene agua, sales y otros componentes hidrosolubles.
   • Pellet: Contiene las proteínas precipitadas.
2. Precipitación del ADN: Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Añadir 1 volumen de isopropanol frío. Mezclar suavemente por inversión. El ADN precipita. Centrifugar para separar el ADN.
3. Lavado y resuspensión del ADN: Eliminar el sobrenadante. Lavar el ADN con etanol al 70%. Resuspender el ADN en agua destilada o tampón apropiado.

Cromatografía de Intercambio Iónico

Se basa en interacciones iónicas reversibles entre:

• Iones de la fase móvil (solución que contiene proteínas, ácidos nucleicos, etc.).
• Grupos iónicos fijos en la fase estacionaria (matriz sólida).

La fase estacionaria puede ser:

• Positiva (+): Intercambiador aniónico $\rightarrow$ retiene aniones ($ ext{−}$), como el ADN.
• Negativa ($ ext{−}$): Intercambiador catiónico $\rightarrow$ retiene cationes ($ ext{+}$), como proteínas y polisacáridos.

Fundamento de la Cromatografía de Intercambio Iónico

Se carga la columna con una dilución del lisado en tampón de baja salinidad. El ADN (carga negativa) se une al intercambiador positivo. Otros componentes (proteínas, polisacáridos) eluyen de la columna. Se realiza un lavado con tampones de concentración salina creciente para eliminar impurezas.

Finalmente, se eluye el ADN usando un tampón de alta salinidad y pH elevado. Para conservar el ADN:

• Precipitación: con isopropanol o etanol.
• Lavado y resuspensión: en agua destilada o tampón.

Cromatografía de Absorción (Sílice)

Los ácidos nucleicos (AN) y el vidrio/sílice están naturalmente recubiertos por capas hidratantes, lo que impide su interacción. Al añadir sales caotrópicas, estas atraen moléculas de agua, eliminando las capas hidratantes. AN y vidrio/sílice quedan expuestos, permitiendo su interacción y unión. Esto se utiliza para adsorber ADN/ARN en columnas con membranas de sílice.

Pasos del Proceso

1. Carga de la columna: Lisado diluido en tampón con agente caotrópico. Centrifugar $\rightarrow$ los AN quedan unidos a la membrana.
2. Lavado: Lavar con etanol para eliminar contaminantes. Centrifugar 2 veces para asegurar eliminación completa de etanol.
3. Elución: Añadir agua destilada o tampón TE (Tris-EDTA) sobre la membrana. Incubación corta y centrifugar $\rightarrow$ el ADN/ARN eluye en el eppendorf. La columna puede desecharse.

Separación Mediante Esferas Magnéticas

Los ácidos nucleicos (AN) se unen a microesferas magnéticas (nanopartículas de magnetita en una matriz inerte). Las microesferas se pueden retener con un imán, lo que permite separar el ADN/ARN del resto de componentes celulares. La unión de los AN a las partículas puede ser por adsorción o afinidad.

Protocolo con Esferas Magnéticas

1. Añadir microesferas magnéticas al lisado junto con un agente caotrópico.
2. Colocar la mezcla en un soporte con imán $\rightarrow$ las esferas (con AN unidos) se atraen al imán.
3. Eliminar el sobrenadante (proteínas y restos celulares) por pipeteo.
4. Lavado: Retirar el tubo del imán y añadir etanol al 70% y agitar.
5. Elución/resuspensión del ADN/ARN: Retirar el tubo del imán. Añadir agua destilada o tampón TE. Incubar para que los AN se separen de las esferas.
6. Colocar de nuevo el imán $\rightarrow$ las esferas quedan retenidas.
7. Recoger el ADN/ARN en solución y transferirlo a un tubo limpio.

Ultrfiltración

Se basa en la retención de ácidos nucleicos por tamaño. Utiliza membranas con poros específicos en la base de columnas. Los productos amplificados de PCR quedan retenidos en el filtro, mientras que los contaminantes pasan al tubo colector.

Pasos de la Ultrfiltración

1. Carga de la muestra: Cargar directamente en la columna y centrifugar. Los productos de PCR quedan retenidos en el filtro, los contaminantes pasan al colector.
2. Lavado: Utilizar etanol al 70% para eliminar restos de contaminantes.
3. Elución / Resuspensión: Añadir agua destilada o tampón TE a la columna. Incubar unos minutos a temperatura ambiente. Recoger los productos de PCR y transferir a un tubo limpio mediante pipeteo.

Consideraciones para la Purificación del ARN

El ARN es extremadamente sensible a la acción de las ARN asas, por lo que requiere condiciones especiales de trabajo:

• Trabajo en cabina de flujo laminar.
• Materiales de trabajo y reactivos certificados libres de ARN asas (incluida el agua destilada).
• Limpieza de superficies con soluciones inactivadoras de ARNasa.
• La solución de lisis debe contener un caotrópico que inactive ARN asas (ejemplo: isotiocianato de guanidinio).