Métodos Avanzados de Purificación y Separación de Proteínas Enzimáticas

Etapas Fundamentales en la Purificación de Enzimas

1. Elección del Material Biológico: Selección de la fuente de la proteína de interés, considerando la facilidad para obtener cantidades suficientes, la concentración de la proteína y sus propiedades peculiares.
2. Extracción y Solubilización de la Proteína: Obtención del extracto crudo a partir del material biológico.
3. Purificación.

Factores que Desnaturalizan o Inactivan Proteínas durante la Extracción y Purificación

Es crucial controlar el entorno bioquímico para mantener la actividad enzimática. Los factores de riesgo incluyen:

1. pH: Se recomienda mantener un pH neutro (generalmente entre 7 y 8).
2. Temperatura (Tª): Es recomendable trabajar a baja temperatura e incluir inhibidores de proteasas y agentes quelantes de iones divalentes, ya que estos iones actúan como cofactores de muchas proteasas.
3. Oxidación: Oxidación de residuos de Cisteína (Cys) con formación de puentes disulfuro no deseados.
4. Contaminación: Uso de agentes antibacterianos como la azida sódica.

Técnicas de Separación de Proteínas

Separación Basada en Solubilidad

La solubilidad de una proteína depende de:

• Interacción polar con moléculas de agua.
• Interacción iónica con las sales presentes.
• Repulsión electrostática entre moléculas de carga similar, lo que disminuye la agregación y aumenta la solubilidad.

Salting In (Solubilización por Salado)

La solubilidad de una proteína en presencia de bajas concentraciones de iones aumenta a medida que se agrega sal. Los iones de la sal rodean los iones de signo contrario en la superficie de la proteína (formando una capa de contraiones), debilitando las fuerzas de atracción entre las moléculas individuales de proteína.

Métodos de Separación por Precipitación

Salting Out (Precipitación por Salado)

Al aumentar la concentración de iones en la disolución, se produce una competencia por las moléculas de agua disponibles. Los iones de la sal se solvatan por moléculas de agua que rodean los parches hidrofóbicos en la superficie de la proteína, los cuales quedan expuestos. Esto facilita que las moléculas de proteína se agreguen y precipiten.

• El sulfato de amonio es el compuesto más utilizado debido a su alta solubilidad.
• A mayor hidrofobicidad de la proteína, menor concentración de sal se requiere para que precipite.
• Para una determinada concentración de sales, una fracción de moléculas permanece soluble y la otra fracción precipita.

Precipitación por Punto Isoeléctrico (pI)

El pI de una proteína es el pH al cual la carga neta de la proteína es cero. A este valor de pH (pH=pI), predominan las formas no cargadas o neutras.

• La solubilidad de la proteína es mínima al valor de pH igual al pI y se incrementa a medida que nos alejamos de ese valor.

Precipitación por Solventes Orgánicos (Acetona, Alcohol)

Los solventes orgánicos compiten con las proteínas por la hidratación de las moléculas de agua, lo que disminuye la solubilidad de la proteína. Además, disminuyen la constante dieléctrica del medio.

Cromatografía en Columna

La cromatografía es una técnica de separación basada en la distribución diferencial de los componentes de una mezcla entre dos fases.

• Fase Móvil: Solvente que fluye a través de la columna, arrastrando a los componentes de la muestra.
• Fase Estacionaria: Matriz sólida y porosa que rellena la columna y no se modifica durante el proceso.
• Elución: Flujo de moléculas a través de la columna.
• Volumen de Elución: Volumen de fase móvil que debe fluir a través de la columna para eluir una determinada molécula presente en la muestra a fraccionar.

Tipos de Cromatografía

Cromatografía de Exclusión Molecular (Filtración en Gel)

Separa las moléculas basándose principalmente en su tamaño.

Cromatografía de Intercambio Iónico

Separa las moléculas basándose en su carga eléctrica.

• La fase estacionaria está formada por resinas de intercambio iónico (ej. resina de intercambio catiónico con grupos CM; resina de intercambio aniónico con grupos DEAE).
• Las proteínas poseen grupos ionizables; según el pH y el pI, poseen una carga neta que les permite interaccionar con la resina.
• Orden de Elución:
  1. Proteínas que no interaccionan con la resina (sin carga o con carga del mismo signo).
  2. Proteínas que interaccionan fuertemente con la columna (con carga opuesta a la resina).

Cromatografía de Afinidad

Separa proteínas por su capacidad de unión específica a otras moléculas de forma no covalente.

1. La mezcla de proteínas se añade a la columna que contiene un ligando específico.
2. La proteína de interés se une a su ligando.
3. Una solución concentrada de ligando libre eluye la proteína de interés.

Electroforesis

La separación de proteínas se basa en la filtración por gel (tamaño y forma) y en el movimiento electroforético (carga eléctrica). La fuerza electroforética mueve macromoléculas cargadas por un potencial eléctrico.

• Las proteínas son moléculas con carga y se mueven en dirección proporcional a su carga e inversa a su masa.

SDS-PAGE (Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecilsulfato Sódico)

Las proteínas se unen al detergente SDS en igual proporción: aproximadamente una molécula de SDS por cada dos residuos de aminoácidos. Esto confiere a todas las proteínas una carga negativa proporcional a su masa molecular, resultando en una relación carga/masa uniforme.

• El SDS-PAGE separa las proteínas exclusivamente por su masa molecular.
• Permite estimar la masa molecular comparando el movimiento electroforético con estándares conocidos.