Métodos Avanzados para la Detección de Autoanticuerpos y Evaluación de la Función Inmunológica

Detección de Autoanticuerpos (AutoAc) Mediante ELISA

Las técnicas inmunoenzimáticas (ELISA) están comenzando a reemplazar a la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI).

Limitaciones de la IFI

• Una de las principales limitaciones de la IFI es la interpretación del resultado, que varía en función de la especificidad del sustrato, el tipo de microscopio utilizado y la subjetividad del observador.
• En muchos casos es imposible identificar el antígeno (Ag) específico contra el cual reacciona el autoanticuerpo (auto-Ac), requiriendo confirmación mediante ELISA.

Fundamento del ELISA Indirecto

El ELISA indirecto permite detectar diferentes auto-Ac a partir del Ag correspondiente. Su fundamento es similar a la IFI, pero con diferencias clave:

• El marcador incorporado al conjugado es diferente.
• El marcador está formado por anticuerpos (Ac) obtenidos de cabras u otras especies que reconocen los dominios constantes de las cadenas pesadas de los Ac humanos.
• Se pueden determinar los isotipos IgG, IgA e IgM y las subclases (IgG1 a IgG4, IgA1 e IgA2), siempre que se disponga del antisuero correspondiente.

Procedimiento del ELISA Indirecto

1. Se tapizan los pocillos con Ag.
2. Se añade el suero problema.
3. Si hay auto-Ac, estos se unirán a los epítopos del Ag.
4. Se añade el conjugado (Ac de cabra anti-Fc-IgG, o Ac frente al isotipo o subclase a determinar, unido a peroxidasa). Si la reacción es positiva, se unirán a los auto-Ac.
5. Se añade el sustrato del enzima y se observa la aparición de color.

Existen técnicas inmunoenzimáticas estandarizadas comerciales para la determinación de las especificidades antinucleares más comunes del Lupus Eritematoso Sistémico (LES). También pueden encontrarse auto-Ac anticolágeno para el diagnóstico de la artritis reumatoide, utilizando como Ag colágeno obtenido a partir de cartílago de tabique nasal bovino.

Detección de Autoanticuerpos por Aglutinación

Esta técnica se utiliza principalmente en el caso de la artritis reumatoide, donde se busca el Factor Reumatoide (FR) en el suero del paciente.

Características del Factor Reumatoide (FR)

• El FR está presente en tres cuartas partes de los pacientes con artritis reumatoide.
• Títulos altos de FR al comienzo de la enfermedad son un signo de mal pronóstico.
• En los últimos años se ha observado un aumento de auto-Ac antipéptidos citrulinados cíclicos (anti-CCP) en suero de enfermos de artritis reumatoide.

Técnica de Aglutinación

1. Se sensibilizan eritrocitos o bolitas de látex con IgG.
2. Se añade suero problema.

Interpretación de Resultados

• Si no hay aglutinación: El suero no contiene FR, resultado negativo.
• Si hay aglutinación: El suero contiene FR, que se une a las IgG. El resultado será una hemaglutinación o una aglutinación de látex, según el soporte utilizado (hematíes o látex).

(Referencia al tema 1)

Estudio de Linfocitos

Separación de Poblaciones Celulares

Las técnicas utilizadas para la separación celular incluyen:

• Separación celular inmunomagnética (MACS).
• Técnicas de inmunotoxicidad.
• Panning para linfocitos.
• Citometría de flujo.
• Filtración con columnas de lana de nailon. Esta última permite obtener linfocitos T libres de linfocitos B y monocitos/macrófagos, ya que estas últimas poblaciones se adhieren a la lana de nailon, mientras que los LT no lo hacen.

Estudio de la Funcionalidad de los Linfocitos B

Para evaluar su funcionalidad se estudia:

• La capacidad de los LB de dividirse en un cultivo in vitro cuando son sometidos a diferentes estímulos.
• La determinación de la producción de anticuerpos, que es un parámetro clave y contribuye al diagnóstico de inmunodeficiencias.

Estudio de la Funcionalidad de los Linfocitos T

El nivel de proliferación de los linfocitos T se puede determinar mediante técnicas basadas en la estimulación y proliferación de los linfocitos que reconocen un antígeno determinado.

Estudio de Proliferación en Respuesta a Mitógenos

Los linfocitos T sensibilizados frente a un antígeno se transforman en linfoblastos y, si se cultivan en presencia de un agente mitógeno, se dividen activamente. La proliferación implica síntesis de ADN, que puede medirse con la tasa de incorporación de timidina tritiada a las células (timidina marcada con tritio, un isótopo radiactivo de hidrógeno). Esta tasa se relaciona con la funcionalidad de los linfocitos T.

Procedimiento de Medición por Incorporación de Timidina

1. Separar los linfocitos mediante centrifugación con medio Ficoll-diatrizoato y recogerlos.
2. Lavarlos varias veces con medio de cultivo celular.
3. Hacer un recuento y ajustar la concentración a $5 \times 10^6$ células/mL con medio de cultivo.
4. Dispensar en placas de microtitulación de 96 pocillos.
5. Incorporar la concentración adecuada de solución de antígeno problema a los pocillos (excepto en los controles).
6. Incubar 72 horas a $37^{\circ}\text{C}$ en atmósfera de dióxido de carbono.
7. Añadir timidina tritiada e incubar mínimo 6 horas.
8. Recoger las células sobre filtros de fibra de vidrio y llevarlas a viales que contengan un líquido de centelleo (para medir la radioactividad).
9. Establecer la tasa de proliferación viendo la relación entre la radioactividad de las células estimuladas con el antígeno y la de las células control, no estimuladas.

Estudio de la Proliferación Mediante Citometría de Flujo

Se utiliza la capacidad del CFSE para marcar los linfocitos y medir la reducción de la intensidad de fluorescencia, la cual es proporcional a su actividad mitótica.

Valoración de Citoquinas

Se valoran las citoquinas en los sobrenadantes de los cultivos estimulados con antígenos o mitógenos.

El procedimiento usado para cuantificar citoquinas es un ELISA sándwich de dos anticuerpos:

1. Tapizar la placa con un anticuerpo monoclonal frente a la citoquina que se quiere determinar.
2. Añadir la muestra problema. Incubar y lavar.
3. Añadir otro anticuerpo monoclonal anti-citoquina, marcado con biotina. Incubar y lavar.
4. Añadir el conjugado (estreptavidina-peroxidasa), incubar y lavar.
5. Añadir el sustrato. Incubar hasta el desarrollo completo de color.
6. Cuantificar el color en un lector de placas ELISA.

A partir de una curva patrón obtenida con citoquinas recombinantes se obtienen los valores de las muestras problema en U/mL. Se consideran positivos los valores que superan en tres desviaciones el valor medio de las muestras control negativas. También se pueden cuantificar células individuales que están secretando una citoquina concreta in vitro mediante ELISPOT:

1. Los pocillos se tapizan con un anticuerpo monoclonal anti-citoquina.
2. Añadir las células estimuladas con el Ag o el mitógeno. Incubar. Si producen citoquinas, estas se unirán a los Ac. Lavar.
3. Detectar las citoquinas mediante un Ac marcado con biotina y un anti-Ac marcado.
4. Precipitación apareciendo puntos en los sitios de unión de las citoquinas.

Por último, existen métodos para determinar citoquinas solubles en el sobrenadante de los medios de cultivo y células productoras de determinadas citoquinas, mediante citometría de flujo.

Estudio de Células Fagocíticas

La evaluación de la funcionalidad de los fagocitos incluye:

• Evaluación de la capacidad fagocítica.
• Evaluación de la activación de los fagocitos.
• Evaluación de la actividad microbicida.
• Ensayos de quimiotaxis.

Evaluación de la Capacidad Fagocítica

Se incuba una fracción de leucocitos de sangre periférica con una suspensión de partículas inertes (microesferas de látex) o de microorganismos (bacterias o levaduras) para permitir la fagocitosis y cuantificarla mediante la observación de las células teñidas. Puede realizarse el mismo estudio por citometría de flujo, marcando bacterias con fluorocromos y estudiando los macrófagos y neutrófilos que las fagocitan.

Inconveniente: No se puede distinguir entre partículas fagocitadas y partículas adheridas a las superficies celulares.

Evaluación de la Activación de los Fagocitos

Se realiza mediante la prueba de reducción del NBT (azul de tetrazolio nitrado), que evalúa el “estallido respiratorio” de los fagocitos tras su activación. Este proceso está inducido por proteínas de membrana y citoplasmáticas (sistema NADPH oxidasa) que generan anión superóxido ($ ext{O}_2^-$) que se transforma en peróxido de hidrógeno ($ ext{H}_2 ext{O}_2$) gracias a la enzima superóxido dismutasa (SOD), existiendo un aumento muy brusco de la demanda de $ ext{O}_2$. Estos compuestos tienen capacidad microbicida.

El NBT es un compuesto químico soluble, de color amarillo en estado oxidado. En estado reducido es insoluble en agua y produce un color azul-púrpura muy intenso, llamado formazán.

Puede usarse para diagnosticar inmunodeficiencias como la Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC), en la que alteraciones genéticas del sistema NADPH oxidasa producen incapacidad de los fagocitos estimulados para reducir el NBT.

Evaluación de la Actividad Microbicida

Consiste en incubar los fagocitos con una cantidad conocida de microorganismos (bacterias o levaduras) y posteriormente realizar un recuento de la viabilidad residual del agente microbiano.

Ensayos de Quimiotaxis

Se usan para cuantificar la locomoción direccional de los neutrófilos atraídos por diferentes estímulos. Para ello se usan dispositivos con dos cámaras aisladas, separadas por un filtro (cámara de Boyden). Los neutrófilos intentan desplazarse hacia el agente quimiotáctico, quedando atrapados en la membrana. Posteriormente, esta membrana se tiñe y se observa al microscopio.

Estudio del Complemento

Cuantificación de las Fracciones C3 y C4

Puede hacerse mediante inmunodifusión radial o inmunonefelometría.

Inconveniente: Detectan tanto componentes funcionales como inactivados y fragmentos de degradación de estos.

Análisis de la Vía Clásica: Técnica CH50

Cuantifica la actividad hemolítica del complemento sérico. Si se mezcla suero fresco con una suspensión de eritrocitos sensibilizados con Ac, el complemento se activará por la vía clásica y se producirá la hemólisis de los eritrocitos.

Si se realiza una curva patrón con volúmenes crecientes de suero problema (que contengan cantidades crecientes de complemento), se puede calcular el volumen de suero que lisa el 50% de los eritrocitos (unidad hemolítica 50 o unidad $ ext{CH}_{50}$). Finalmente, se calcula el número de unidades $ ext{CH}_{50}$ por mL de suero.

Técnica de Hemólisis en Gel de Agarosa

Es una modificación de la técnica anterior. Utiliza como sistema lítico eritrocitos sensibilizados con Ac, incorporados a un gel de agarosa. En el gel se excavan pocillos en los que se añade suero con complemento activo. El complemento difunde radialmente por el gel y genera un halo de lisis de los eritrocitos, cuyo diámetro será proporcional a la concentración y funcionalidad del complemento presente en la muestra.