Metodología de Electroforesis: Preparación, Revelado y Cuantificación de Muestras Biológicas

Fundamentos y Aplicaciones de las Técnicas Electroforéticas

1. Preparación y Ejecución de la Electroforesis

El proceso de electroforesis requiere una preparación meticulosa de los componentes antes de la siembra y la aplicación de la corriente eléctrica.

1.1. Fases de Preparación

• Preparación de la Muestra: Se aplican medios de separación para conseguir una muestra altamente concentrada.
• Preparación del Soporte: En el caso de los geles, se debe preparar con la composición adecuada, colocarlo en un molde y asegurar que tenga el grosor y la textura correctos.
• Preparación del Tampón: Si no se utiliza el tampón comercial, es necesario preparar las disoluciones específicas.

1.2. Siembra de la Muestra

Una vez preparados los componentes, se procede a la siembra de la muestra:

• Orientación de la Carga: Si las moléculas tienen carga positiva (+), se colocan cerca del ánodo para que migren hacia el cátodo, y viceversa.
• Método de Siembra: La siembra depende del soporte. A veces hay unos pocillos en los que se deposita la muestra con la micropipeta, y otras veces se deposita una pequeña cantidad controlada directamente en el medio.

1.3. Ejecución y Resultado

Finalmente, se seleccionan los parámetros eléctricos y el tiempo, poniendo en marcha el equipo. Cuando está en funcionamiento, las sustancias migran a través del medio.

El resultado se manifiesta en bandas, donde cada una corresponde a una sustancia diferente. Posteriormente, se realiza el revelado, que generalmente implica la adición de colorante y un proceso de lavado.

1.4. Interpretación y Cuantificación

La información recogida debe ser interpretada. Dependiendo de esto, se procede a la cuantificación mediante:

• Espectrofotometría
• Densitometría

2. Electroforesis en Cellogel: Revelado y Cuantificación Específica

El Cellogel es un soporte común que requiere un protocolo de revelado específico para la visualización y posterior cuantificación de las fracciones proteicas.

2.1. Protocolo de Revelado en Cellogel

1. Retirar la tira de la cubeta y dejarla 10 minutos en la solución colorante.
2. Decoloración: Pasar la tira por tres o cuatro bateas llenas de líquido decolorante, hasta ver las bandas en un fondo claro.
3. Transparentación: Pasar la tira por la solución transparentadora (generalmente una mezcla de metanol y ácido acético).
4. Eliminar el exceso de líquido colocando la tira entre dos hojas de papel de filtro.

2.2. Obtención del Informe y Cuantificación

El informe final suele venir expresado en un porcentaje de cada fracción respecto a la concentración total. Esta información se puede obtener mediante dos técnicas principales:

A. Cuantificación por Espectrofotometría

Se recortan las franjas (bandas), se introducen en tubos para que el contenido salga del Cellogel (cada franja en una disolución diferente). Se mide la absorbancia y se compara con la medida total.

B. Cuantificación por Densitometría

Un fotómetro mide el colorante que se ha fijado en cada franja y lo representa en un proteinograma. Este gráfico muestra las fracciones de cada proteína en relación con las totales. Para esta técnica, es crucial que el fondo del soporte sea transparente.

3. Inmunoelectroforesis: Combinación de Separación y Detección Inmunológica

La inmunoelectroforesis es una técnica potente que combina la electroforesis en gel de agarosa seguida de una inmunodifusión.

3.1. Proceso de Ejecución

1. Aplicación de la Muestra: La muestra se aplica en un punto, por lo que las proteínas se distribuyen por el gel según el eje de migración.
2. Canalización: Cuando se acaba la electroforesis, se hace un canal sobre el gel con un bisturí, paralelo a la dirección de migración.
3. Adición del Antisuero: En este canal se deposita el antisuero, que contiene anticuerpos frente a las proteínas.
4. Incubación: El gel debe estar a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas.

3.2. Principio de Detección y Sensibilidad

Las proteínas (que tienen función de antígeno) y los anticuerpos producirán complejos antígeno-anticuerpo insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas.

La fuerte sensibilidad de estas reacciones permite:

• Separar sustancias con movilidades electroforéticas iguales.
• Detectar componentes que se encuentran en concentraciones mínimas.