Metodología Avanzada para la Detección de Tóxicos Orgánicos en Cereales Infantiles

Introducción: Detección de Tóxicos Orgánicos en Cereales Infantiles

El presente documento describe la metodología para la determinación de los niveles de un tóxico orgánico en cereales destinados a la alimentación infantil. Este estudio se enmarca en el proyecto ORG-SOL.

Muestreo y Recogida de Muestras

Zona y Periodo de Muestreo

Para ello, tomamos como zona de muestreo una fábrica de cereales de Bilbao donde se ha detectado la presencia de este tóxico orgánico entre los meses de septiembre y diciembre. El dueño de la fábrica nos informa de que antes de estas fechas se comprobó que no había presencia de nuestro analito; por lo tanto, cogeremos esos cereales como matriz blanco.

Consideraciones sobre el Analito

Al tratarse de un analito orgánico, sufre biotransformación con el tiempo. Se toman muestras a diferentes tiempos hasta la desaparición y constancia del analito.

Transporte y Almacenamiento de Muestras

Para llevarla al laboratorio, necesitaré un contenedor inerte para evitar la contaminación de la muestra. Dicha contaminación puede ser positiva o negativa: transferencia del material del contenedor a la muestra, o adsorción del analito por el recipiente. Para evitar cualquiera de las anteriores, elegiré un contenedor de vidrio.

Una vez elegido el modo de transporte, codifico la muestra con todos aquellos datos que puedan explicar cualquier resultado extraño. Supongo que desde la toma de muestra hasta la llegada al laboratorio transcurre poco tiempo; las condiciones de temperatura del transporte son de 4ºC.

Preparación de la Muestra en Laboratorio

Submuestreo y Homogenización

Al laboratorio llegará todo lo que he muestreado y haré un submuestreo para seleccionar una muestra sin que esta pierda la representatividad. Al ser una muestra sólida, haré una homogenización. Para ello, trituraré la muestra hasta conseguir un tamaño de partícula lo más pequeño posible.

Cuarteado

Después, realizaré un cuarteado las veces que sea necesario hasta conseguir una muestra pequeña y suficientemente representativa.

Etapa de Solubilización

Selección del Disolvente y Equilibrio

Más tarde, pasaré a la etapa de solubilización. Cogeré mi muestra con mi analito, que presupongo que presentará una estructura apolar; por tanto, el disolvente que yo elija será también apolar, de manera que el disolvente se quede enriquecido con mi analito.

Se tiene que conseguir el siguiente equilibrio:

• Concentración analito sólido ⇇ Concentración analito líquido
• Kd = Concentración analito líquido / Concentración analito sólido

Para conseguir una alta Kd y que el líquido esté enriquecido con mi analito, utilizo un extractante adecuado y afín con el analito.

Método de Solubilización Agresivo

Como la unión del analito a la matriz es fuerte, conlleva a utilizar un método de solubilización agresivo. Elijo el horno microondas, debido a que el tiempo no es elevado, el volumen de disolvente no es alto y los rendimientos son adecuados. Sin embargo, plantea un problema: necesito que el disolvente presente momento dipolar. Para ello, elegiré otro disolvente que presente un momento dipolar para favorecer el efecto sinérgico.

Eliminación de Interferencias

Necesidad de Eliminación

Una vez acabada la solubilización, aunque haya utilizado un disolvente adecuado, puede ocurrir que sigan existiendo interferencias porque algún componente de la matriz puede tener propiedades semejantes al analito y pasar a la etapa de solubilización. Para evitar que la señal quede solapada con las interferencias del analito, se lleva a cabo un proceso de eliminación de interferencias. Eliminamos las interferencias para conseguir mayor selectividad en la medida.

Microextracción en Fase Sólida (SPME)

Utilizo microextracción en fase sólida (SPME), que permite estudiar valores muy pequeños de muestra. La microextracción se inyecta directamente en cromatografía.

En microextracción en fase sólida, disponemos de una microfibra donde se extiende el sólido. Consiste en la transferencia del analito a la fase sólida, sin interferencias. La elección del sólido es importante, ya que este deberá ser más compatible con el analito que está en el disolvente de la fase 1.

• Fase 1: fase líquida (analito + interferencias)
• Fase 2: fase sólida (analito)

Al igual que antes con el extractante, ahora se debe establecer una Kd elevada. El sólido de extracción que voy a elegir será apolar porque el analito también lo es. Se establecerán enlaces C-H con la superficie del sólido.

Ajuste de Parámetros en Fase Líquida

De la fase 1 no es necesario conocer todas las propiedades del disolvente, pero sí es importante ajustar la fuerza iónica y el pH.

• Fuerza Iónica: Es la concentración de sales en disolución. Afecta siempre. Un aumento de estas sales facilita la transferencia del analito a la fase II. Esto sucede porque a mayor concentración de sales, el disolvente de la fase 1 solvatará, dejando el analito libre.
• pH: Solo influye en especies que intervienen en equilibrios ácido-base. Supongo que mi analito no interviene en esto.

Activación del Sólido y Selección

Conozco la naturaleza del sólido es apolar, pero este sólido tiene que ser activado para abrir las moléculas y que los puntos de unión al sólido sean accesibles. Para la activación, utilizo un disolvente de activación que pase por la superficie del sólido. El residuo, al ser diferente al de la fase 1, lo elimino con una corriente de aire.

Los sólidos ya están activados; ahora he de elegir el sólido adecuado que retenga mi analito, pero no las interferencias. Para ello, realizo patrones a flujo constante para el sólido apolar y tomo una medida a la salida y otra a la entrada para comparar resultados. Una vez hecho esto, realizo una disolución mezcla de los analitos y compruebo que es adecuado.

Por último, tomo la matriz blanco para la elección de un sólido que no retenga las interferencias y así evitar ruido en la señal. Paso la matriz blanca por sólidos seleccionados y mido tanto a la entrada como a la salida. Realizo la matriz espikeada, que es la matriz blanco a la que se le añade analito y veo el rendimiento.

Cromatografía Líquida

Principios y Modos de Operación

Con esto, paso a la cromatografía. Al tratarse de un analito orgánico, pueden aparecer nuevos analitos debido a las transformaciones que pueda sufrir el analito. En cromatografía, se dispone de una fase móvil y una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad del analito por la fase estacionaria, el analito quedará retenido más o menos tiempo.

Utilizo una cromatografía líquida donde la fase móvil es un líquido y la fase estacionaria un líquido activo cromatográficamente. Trabajo en modo isocrático porque los analitos son similares entre sí, y también en fase reversa: fase móvil polar y fase estacionaria apolar.

Detectores en Línea

Vamos a utilizar dos detectores en línea:

1. Detector de Amperometría de Oxidación

   Pongo un primer detector de amperometría de oxidación. En esta técnica, tenemos una celda de medida en la que tenemos nuestro analito + medio iónico + tampón. Junto a la celda, tenemos también un electrodo de trabajo (al ser amperometría de oxidación, el rango de potencial en el que mido es desde 0V hasta 1,2V; el electrodo está constituido por carbono), un electrodo de referencia y un tercer electrodo auxiliar (en su superficie va a descargarse la resistencia al paso de corriente eléctrica que se dé en la celda, constituido por barra de Pt). Aplico a la superficie del electrodo un potencial específico del analito, de forma que cuando el analito presente en la celda llegue a la superficie electrodica, se oxide.

2. Detector de UV de Absorción Molecular

   En línea con el primero, pongo un segundo detector de UV de absorción molecular. Al interaccionar radiación y materia, el analito sufre una modificación y, como consecuencia de esta interacción, vamos a obtener un espectro de radiación continua que será específico del analito. Necesito también un soporte para la materia, en este caso una cubeta de cuarzo.

Ventajas de los Detectores en Línea

La ventaja de poner estos dos detectores en línea es que así aumento la sensibilidad. La amperometría de oxidación es una técnica mucho más selectiva que la absorción molecular, ya que solo va a dar señales de aquellas moléculas que se oxiden. Sin embargo, con la absorción molecular me aseguro de recoger las señales de todos los compuestos que estén en mi fase móvil, ya que es una técnica universal (poco selectiva) con la que prácticamente todos los compuestos pueden ser analizados.

Método de Cuantificación: Patrón Interno (PI)

Para el método de cuantificación, seleccionamos el método de Patrón Interno (PI) debido a que al inyectar la muestra con una jeringa, suele cometerse un error. Por tanto, realizamos un calibrado referido a un compuesto que escogemos como PI.

Preparamos un calibrado de forma que a cada disolución patrón y a la muestra problema le añadimos la misma cantidad de PI. Realizamos la medida de la señal analítica y hacemos un ajuste lineal, representando Señal A / Señal PI frente a la concentración de analito. Al dividir, nos aseguramos de minimizar el error cometido en cada inyección. Finalmente, el valor de Señal A / Señal PI obtenido para la muestra problema se interpola en el ajuste.