Mètodes de Seqüenciació d'ADN: Sanger, Maxam-Gilbert i NGS

Què és la seqüenciació del DNA?

És el procés mitjançant el qual es determina l'ordre exacte dels nucleòtids (adenina, timina, guanina i citosina) en una molècula d’ADN. Aquesta tècnica permet identificar la informació genètica i és fonamental per a estudis genètics, la investigació de malalties, etc.

Mètode químic de Maxam i Gilbert

És una tècnica de seqüenciació de l’ADN basada en la modificació química selectiva dels nucleòtids. Cada tipus de nucleòtid es modifica de manera específica, i després es talla l’ADN en punts determinats. Els fragments resultants se separen per electroforesi, permetent deduir l'ordre dels nucleòtids.

Mètode de Sanger

El mètode de Sanger és una tècnica de seqüenciació que utilitza nucleòtids marcats i dideoxirribonucleòtids per interrompre l’allargament de la cadena d’ADN. Els fragments resultants se separen per electroforesi, revelant l’ordre dels nucleòtids.

Passos de la seqüenciació Sanger

1. Amplificació per PCR del fragment que es vol seqüenciar.
2. Purificació del producte de PCR.
3. Reacció de seqüenciació.
4. Precipitació de l’ADN.
5. Electroforesi.
6. Lectura de la seqüència.

Limitacions del mètode Sanger

• Només pot llegir fragments d’ADN curts (fins a 800pb).
• És més costós i lent en comparació a altres tècniques.
• No és eficaç per seqüenciar genomes complets.
• No és quantitativa.
• Té un límit de sensibilitat del 20%.

Diferències entre Maxam-Gilbert i Sanger

• Sanger utilitza ddNTPs i Maxam i Gilbert utilitza modificacions químiques selectives.
• En Sanger es fa l’electroforesi i es llegeix per les terminacions de les cadenes. En Maxam i Gilbert també es fa electroforesi, però depèn de la modificació química.
• En Maxam-Gilbert es poden seqüenciar un màxim de 100pb i en Sanger fins a 800pb.
• Sanger, primer fa PCR; Maxam-Gilbert no.

Seqüenciació massiva (NGS)

És una tècnica avançada que permet seqüenciar l'ADN o ARN de manera ràpida i a gran escala.

Avantatges de la NGS

• Pot seqüenciar milions de fragments simultàniament (tot un genoma).
• És molt més ràpid que els mètodes tradicionals.
• Permet detectar variants genètiques rares, mutacions, etc.

Aplicacions de la seqüenciació massiva (NGS)

• Genòmica: Seqüenciació del genoma complet (WGS).
• Transcriptòmica: Seqüenciació de l’ARN complet.
• Metagenòmica: Seqüenciació de diferents tipus de bacteris.
• Epigenòmica: Immunoprecipitació de cromatina (ChIP-seq).

Passos del mètode NGS

1. Preparació de l’ADN motlle (fer llibreria): Fragmentació de l’ADN i afegiment d’adaptadors als extrems.
2. Generació de clústers: Multiplicació dels fragments mitjançant PCR.
3. Seqüenciació: Lectura dels nucleòtids amb fluorescència o sensors.
4. Anàlisi de dades: Reconstrucció i interpretació de la seqüència.

Seqüenciació de tercera generació

Són plataformes automàtiques dissenyades per seqüenciar molècules úniques d’ADN, sense necessitat d’amplificació clonal prèvia, com passa amb les de 2a generació. És una tècnica avançada que permet llegir molècules d'ADN o ARN de forma contínua i en temps real, sense necessitat d'amplificar-les prèviament.

Avantatges de la seqüenciació de tercera generació

• Pot seqüenciar fragments molt llargs (fins a 10.000 nucleòtids).
• Permet obtenir resultats més ràpid.
• No es fa PCR.
• Té millor precisió en seqüències difícils.

Veritable o Fals: Mètode Maxam-Gilbert

Respecte al mètode químic de seqüenciació de Maxam i Gilbert, respon si les afirmacions següents són veritables o falses. Justifica les falses:

Es basa en la modificació de les bases nitrogenades mitjançant reaccions químiques específiques. Veritable

És un mètode que requereix marcatge radioactiu amb 32P. El marcatge s’introdueix a cada base nitrogenada durant la reacció química de modificació. Fals. El marcatge radioactiu s’incorpora abans de les reaccions químiques. Al principi, els nucleòtids han d’estar marcats separadament.

La mostra es divideix en quatre tubs, en cadascun dels quals es fa una reacció química específica que modifica una de les quatre bases. Fals. Només en marca 2, els altres 2 són la suma i no estan marcats.

Les reaccions químiques generen fragments de diferents longituds que se separen mitjançant una electroforesi en gel de poliacrilamida en condicions desnaturalitzants. Els productes de les quatre reaccions químiques es corren en paral·lel als carrers adjacents del mateix gel. Veritable

La lectura del gel s’efectua il·luminant-lo amb llum UV i obtenint-ne una fotografia. Fals. La lectura es fa llegint la fotografia de l’autoradiografia del gel, no utilitza llum ultraviolada.

Diferències i semblances: 1a vs 2a generació

Assenyala les principals diferències que hi ha entre els mètodes de seqüenciació de 1a i 2a generació. Hi ha alguna semblança?

Diferències

• 1a generació (Sanger, Maxam-Gilbert): Seqüenciació per terminació de cadena (Sanger) o modificació química (Maxam-Gilbert), limitat en termes de velocitat i més car per seqüenciar grans quantitats de dades.
• 2a generació (NGS): Seqüenciació paral·lela massiva (permet fer moltes lectures alhora), major capacitat i velocitat, i menys costós per obtenir grans quantitats de dades.

Semblances

Ambdós mètodes basen la seqüenciació en la lectura de la seqüència de bases d'ADN a través de la detecció de nucleòtids incorporats en una cadena d'ADN.