Mètodes de Determinació CMI i CMB: Guia Completa d'Antibiogrames

Determinació de la CMI per Macrodilució en Tub

Preparació de l'Antimicrobià

Es preparen dilucions dobles seriades de l’antibiòtic en tubs amb 1 mL de medi. Com es barrejarà amb 1 mL d’inòcul, la concentració es reduirà a la meitat. Per aquest motiu, les dilucions s’han de preparar al doble de la concentració desitjada (per exemple, si es vol començar a 32 µg/mL, es prepara a 64 µg/mL).

Preparació de l’Inòcul

Es prepara una suspensió bacteriana ajustada a 0,5 de l’escala de McFarland. Es realitza una dilució 1:100 per obtenir una concentració de 10⁶ CFU/mL. Un cop barrejat amb l’antibiòtic, la concentració final queda en 5×10⁵ CFU/mL.

Procediment

1. Es barreja 1 mL d’inòcul amb 1 mL de la dilució d’antibiòtic en cada tub.
2. Es realitza una incubació de 18-24 hores.
3. Es comprova el creixement bacterià.
4. La concentració mínima d’antibiòtic que impedeixi el creixement del cultiu es considera la CMI.

Determinació de la CMB

1. Subcultiu: A partir dels tubs on s’ha determinat la CMI, es realitza un subcultiu en plaques sense antibiòtic, només dels tubs sense creixement.
2. Incubació: Les plaques s’incuben durant 24 hores.
3. Comptatge de colònies: Es quantifiquen les UFC finals per determinar els bacteris supervivents. Les UFC inicials corresponen a l’inòcul inicial del tub (5×10⁵ UFC/mL).
4. Càlcul del percentatge de supervivència: % = UFC finals/UFC inicials*100. Un antibiòtic bactericida no sempre esterilitza al 100%.

La CMB es defineix com la concentració mínima que permet la supervivència de menys del 0,1% de l’inòcul inicial. Sempre serà igual o superior a la CMI.

Determinació de la CMI amb el Mètode de Microdilució

Fonament

Mateix principi que la dilució en tubs, però es realitza en una microplaca de 96 pous.

Procediment

Es fan dilucions dobles seriades de l’antibiòtic a la microplaca. Es poden testar diversos antibiòtics simultàniament (un per fila). S’afegeix l’inòcul, ajustant la concentració final a 5×10⁵ CFU/mL.

Incubació i Lectura

S’incuba durant el temps requerit. La lectura pot ser manual o automatitzada.

Interpretació

La CMI és la concentració d’antibiòtic del primer pou sense creixement bacterià.

Plaques Multitest: Identificació i Sensibilitat (CMI)

Combinen proves d’identificació i proves de sensibilitat (CMI) en una mateixa placa.

Identificació

Es realitza a la part superior mitjançant proves bioquímiques.

Sensibilitat

A la part inferior, amb diferents concentracions d’antibiòtics (1, 2, 4, 8 µg/mL...). La terbolesa en un pou indica creixement bacterià.

Determinació de la CMI amb el Mètode de Difusió de Disc (Kirby-Bauer)

Fonament del Mètode

No proporciona la CMI directament. L’antibiòtic es difon radialment des del disc en l’agar, creant un gradient de concentració. La concentració crítica es troba a la interfase entre la zona d’inhibició i la de creixement, aproximant-se a la CMI. La CMI s’extrapola mesurant el diàmetre de la zona d’inhibició segons valors estandarditzats per cada antimicrobià.

Procediment

1. Preparació de l’inòcul: ajustat a 0,5 de l’escala de McFarland (la terbolesa pot variar segons el microorganisme).
2. Sembra homogènia: en placa amb un escovilló, en 3 direccions.
3. Aplicació dels discs: d’antibiòtic a la superfície de l’agar inoculat.
4. Incubació: segons EUCAST (16-20 h o més).
5. Lectura: dels halos d’inhibició i interpretació segons els valors estandarditzats.

Interpretació Clínica de les CMI i els Halos d’Inhibició

Per determinar si un microorganisme és tractable o no amb un antibiòtic, EUCAST estableix punts de tall clínics (clinical breakpoints) per cada combinació microorganisme-antimicrobià. Aquests punts de tall permeten interpretar tant la CMI com el diàmetre de la zona d’inhibició.

Categories Clíniques segons EUCAST (des de 2019)

• Sensible, règim de dosificació estàndard (S): Alta probabilitat d’èxit terapèutic amb la dosi habitual.
• Sensible, quan s’incrementa l’exposició (I): Alta probabilitat d’èxit terapèutic si s’ajusta la dosi, la via d’administració o es millora la concentració de l’antibiòtic al lloc d’infecció.
• Resistent (R): Alta probabilitat de fracàs terapèutic, fins i tot augmentant l’exposició a l’antibiòtic.

Factors que Influeixen en l'Exposició de l'Antibiòtic

• Via d’administració
• Dosi i interval de dosificació
• Temps d’infusió
• Distribució i excreció de l’antimicrobià
• Influència en el pacient i el lloc de la infecció

Prova de l’Epsilòmetre (E-test)

Expansió de la tècnica de difusió en disc, permetent determinar la concentració mínima inhibitòria (CMI). Utilitza una tira de plàstic no porós amb un gradient predefinit d’antibiòtic equivalent a 15 dilucions.

Procediment

1. Es prepara l’inòcul amb el mateix protocol que per la difusió en placa.
2. S’inocula la placa d’agar amb el microorganisme.
3. Es col·loca la tira E-test sobre la superfície, permetent la difusió immediata de l’antibiòtic, creant un gradient exponencial de concentracions.
4. Després de la incubació, es forma una zona d’inhibició elipsoidal i simètrica. La CMI correspon al punt on l’extrem de la zona d’inhibició intersecciona amb la tira.