Mètodes d'Aïllament i Caracterització de Macromolècules Biològiques

Introducció als Mètodes d'Aïllament de Macromolècules

Existeixen dos tipus de metodologies principals:

• Mètodes preparatius: S'utilitzen per purificar una macromolècula o enriquir una mostra determinada.
• Mètodes analítics: S'utilitzen per determinar les propietats d'una mostra.

El primer pas per purificar una macromolècula consisteix en fer una disrupció de les cèl·lules o teixit que la contenen. Aquesta disrupció implica el trencament de membranes cel·lulars. Un cop feta aquesta disrupció, obtenim un homogenat o extracte cru.

Centrifugació Diferencial

Permet sedimentar de forma específica cèl·lules, orgànuls i macromolècules biològiques. És un mètode preparatiu.

L'acceleració centrífuga es defineix com: Ac = w²·r

Una partícula sotmesa a Ac experimentarà una força centrífuga: Fc = m'w²·r

Durant la centrifugació, el medi que envolta la partícula exercirà una força de fricció fv en sentit contrari a Fc, i la partícula sedimentarà a velocitat constant.

Ultracentrifugació

Definim el coeficient de sedimentació, S, com: S = v / w²r

El coeficient de sedimentació està directament relacionat amb la massa de la partícula:

S = m(1-vρ) / f

Centrifugació en Gradient de Densitat

Metodologia preparativa i analítica.

Precipitació Salina i Diàlisi

La majoria de les proteïnes precipiten en presència de concentracions salines elevades.

La diàlisi es realitza en sacs d'acetat de cel·lulosa que només permeten el pas de partícules petites (menys de 5-10 kDa). Permet eliminar les sals o canviar el tampó en el qual es troba una macromolècula.

Cromatografia

Les cromatografies permeten separar compostos en base a diferències en la seva càrrega, pes molecular o afinitat per altres compostos.

• Fase mòbil: Solució tampó que conté la mostra problema, que circula a través d'una fase estacionària.
• Fase estacionària: Matriu porosa, habitualment una resina, que s'encarrega de separar els compostos.

Les cromatografies es realitzen en columnes de vidre o plàstic. Com més llarga és la columna, major resolució (capacitat de separació).

Cromatografia d'Exclusió Molecular (Gel-Filtració)

La resina consisteix en un polímer porós pel qual podran entrar i circular les molècules petites, que aniran quedant retingudes de forma diferencial respecte les molècules més grans, que no entraran o entraran molt menys en la resina. Metodologia preparativa i analítica.

Cromatografia de Bescanvi Iònic

La resina utilitzada consisteix en un polímer que porta enllaçada una molècula fortament carregada:

• Negativament: bescanvi catiònic (CM)
• Positivament: bescanvi aniònic (DEAE)

Permet separar proteïnes amb diferent punt isoelèctric. Bàsicament preparativa.

Cromatografia d'Afinitat

Algunes proteïnes tenen afinitat per determinats compostos (lligands). Aquest lligand es pot immobilitzar sobre la resina. Si es fa circular una barreja complexa de proteïnes, només aquelles amb afinitat pel lligand seran retingudes. Les proteïnes retingudes es poden eluir fent circular una solució amb excés de lligand com a fase mòbil. És bàsicament preparativa.

Electroforesi

• Molècules amb càrrega neta, sotmeses a un camp elèctric, es desplaçaran cap a un dels dos pols amb velocitat: v = Ez / 6·π·η·r
• Per tal de limitar la difusió de molècules, l'electroforesi es realitza a través d'una malla inert o suport per on han de viatjar les molècules.
• Els suports més utilitzats són de poliacrilamida i d'agarosa. Com més gran sigui el radi de la partícula, més alt serà el seu fregament amb la malla.

Metodologia analítica.

Electroforesi en Gel de Poliacrilamida i SDS (SDS-PAGE)

La poliacrilamida proporciona una malla inert que permet separar proteïnes i àcids nucleics petits (menys de 500 nucleòtids). En presència d'SDS, les proteïnes es desnaturalitzen. L'SDS interacciona amb les proteïnes conferint-los càrrega neta negativa. Aleshores, totes les proteïnes, independentment de la seva càrrega original, es desplacen cap a l'ànode i es resolen d'acord amb la seva massa molecular.

Isoelectroenfocament (IEF)

• Les proteïnes es resolen segons el seu punt isoelèctric (no SDS).
• S'utilitzen gels d'acrilamida amb polianfòlits. Els polianfòlits són barreges complexes de molècules orgàniques amb diferents graus de substitucions amb grups amino i carboxil.
• En presència d'un camp elèctric i de pH àcid en l'ànode i pH bàsic en el càtode, formen un gradient de pH molt estable al llarg del gel d'acrilamida.
  • pH ↑ que pI: càrrega negativa neta
  • pH = pI: càrrega neta 0
  • pH ↓ que pI: càrrega positiva neta

Electroforesi Bidimensional

• Fa de forma seqüencial un isoelectroenfocament i un SDS-PAGE.
• Permet separar barreges molt complexes de proteïnes.
• Combinada amb l'espectrometria de masses ha donat lloc al que es coneix com a proteòmica: identificació de totes les proteïnes de l'organisme.

Quantificació dels Protocols de Purificació

• Proteïna total: Quantitat total de proteïna. Només es mesura una petita alíquota i es multiplica pel volum total.
• Activitat total: Es mesura l'activitat enzimàtica d'una petita alíquota i es multiplica pel volum total.
• Activitat específica: Quocient entre activitat total / proteïna total.
• Rendiment: Percentatge d'activitat prenent com a referència l'activitat de l'extracte cru.
• Grau de purificació: Quocient entre l'activitat específica de cada pas i l'activitat específica de l'extracte inicial.

Espectrofotometria

La mesura de la llum absorbida mitjançant un espectrofotòmetre permet detectar i identificar molècules en solució, així com determinar-ne la seva concentració.

Llei de Lambert-Beer: Absorbància (A) = log I₀/I = ε·c·l (l'absorbància és directament proporcional a la concentració).

Metodologia analítica.

Espectrometria de Masses

• Es generen ions de proteïnes que s'acceleren en un camp elèctric en el buit.
• Després es mesura el temps de vol fins a arribar al detector del final del tub.
• El temps de vol és directament proporcional a la relació de massa/càrrega (m/z).
• Permet determinar de forma molt precisa la massa de proteïnes i àcids nucleics.

Determinació d'Estructures Tridimensionals

• Cristal·lografia de Raigs X: Requereix prèviament obtenir cristalls de la proteïna d'interès. No hi ha limitació de mida i proporciona estructures amb un elevat grau de resolució (menys de 0,2 nm).
• Ressonància Magnètica Nuclear (RMN): Permet obtenir l'estructura de macromolècules en dissolució, però presenta una limitació en la mida de les proteïnes a estudiar (menys de 10 kDa).

Mètodes Immunològics

• Anticossos: Proteïnes sintetitzades per un animal en resposta a la presència d'una substància aliena anomenada antigen.
• Un anticòs té una elevada especificitat i afinitat per l'antigen que provoca la seva síntesi.
• Un anticòs determinat només reconeix una petita part d'un antigen. La part reconeguda de l'antigen rep el nom d'epítop o determinant antigènic.
• Els enzims es poden conjugar de forma covalent amb els anticossos al laboratori. La proteïna resultant conserva l'especificitat de l'anticòs i disposa de l'activitat de l'enzim original.
• Podem determinar l'activitat de molts enzims utilitzant substrats cromogènics. Aquests substrats canvien de color en ser processats pels enzims.
• Es poden obtenir anticossos contra altres anticossos (anticossos secundaris).