Medios de Cultivo Microbiológicos: Composición, Tipos y Preparación Detallada

Medios de Cultivo: Fundamentos y Aplicaciones

Los medios de cultivo son soluciones que contienen las sustancias imprescindibles para el crecimiento de bacterias y otros microorganismos, como los hongos unicelulares. Se emplean fundamentalmente para el estudio de estos microorganismos.

Los medios de cultivo sólidos no solo sirven como fuente de nutrientes, sino también como soporte físico, permitiendo que las bacterias crezcan formando colonias visibles a simple vista.

Componentes Esenciales de los Medios de Cultivo

Los medios de cultivo están compuestos por diversos elementos que satisfacen los requerimientos nutricionales y ambientales de los microorganismos:

Componentes Básicos

• Proteínas (o sus derivados como peptonas, aminoácidos)
• Hidratos de carbono (fuente de energía)
• Iones metálicos y no metálicos (sales minerales, oligoelementos)

Agar

El agar es un polisacárido extraído de algas marinas que las bacterias generalmente no utilizan como nutriente. Su función principal es actuar como agente solidificante de los medios, proporcionando una superficie para el crecimiento.

Componentes Facilitadores

• Soluciones tampón (buffer): Mantienen el pH del medio dentro de un rango óptimo.
• Vitaminas y factores de crecimiento: Sustancias orgánicas necesarias en pequeñas cantidades que algunos microorganismos no pueden sintetizar.

Componentes Inhibidores

• Indicadores y colorantes: Sustancias que cambian de color en respuesta a cambios químicos (ej. pH) o que ayudan a visualizar/diferenciar colonias. Algunos pueden ser selectivos.
• Antibióticos u otras sustancias selectivas: Inhiben el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos, permitiendo el aislamiento de otros.

Nutrientes Excepcionales

Algunos microorganismos con requerimientos nutricionales específicos pueden necesitar:

• Ácidos nucleicos (o sus precursores)
• Esteroles

Clasificación Detallada de los Medios de Cultivo

Los medios de cultivo se pueden clasificar según diversos criterios:

Según la Naturaleza de los Componentes

• Naturales: Elaborados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal cuya composición exacta no se conoce completamente (ej. extracto de levadura, infusión de cerebro y corazón).
• Sintéticos o definidos: Químicamente definidos, todos sus componentes y sus cantidades son conocidos.
• Semisintéticos: Mezcla de componentes sintéticos definidos y componentes naturales (ej. agar nutritivo con extracto de levadura).

Según su Utilización

• Medio base o generales: Permiten el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos no exigentes (ej. agar nutritivo).
• Medios de aislamiento:
  • Enriquecidos: Contienen nutrientes adicionales (sangre, suero, huevo) para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes.
  • Diferenciales: Permiten distinguir tipos de microorganismos por las características de sus colonias o por cambios en el medio (ej. agar MacConkey, que diferencia lactosa-positivos de lactosa-negativos).
  • Selectivos: Contienen sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos mientras permiten el de otros (ej. agar Salmonella-Shigella).
  • Electivos o de enriquecimiento (líquidos): Favorecen el crecimiento de un tipo particular de microorganismo presente en una muestra mixta, usualmente inhibiendo a los demás.
• Medios de identificación: Utilizados para realizar pruebas bioquímicas que ayudan a identificar microorganismos según sus capacidades metabólicas (ej. TSI, LIA).
• Medios de conservación y mantenimiento: Diseñados para mantener la viabilidad de los microorganismos durante periodos prolongados con mínima actividad metabólica.
• Medios para ensayos: Utilizados para pruebas específicas, como la determinación de la sensibilidad a antibióticos (ej. agar Mueller-Hinton) o el recuento de microorganismos.

Según su Preparación

• Preparación a partir de los componentes individuales de la fórmula, pesando cada uno.
• Hidratando medios comerciales deshidratados (liofilizados), que ya contienen todos los componentes en las proporciones correctas.
• Adquiriendo medios ya preparados y esterilizados, listos para su uso.

Según su Presentación o Consistencia

• Medios de una sola fase:
  • Sólidos: Contienen un agente solidificante (generalmente agar al 1.5-2%). Se presentan en placas de Petri, tubos inclinados (slants) o tubos con agar profundo (deeps).
  • Semisólidos: Contienen una menor concentración de agar (0.05-0.5%). Se usan para observar la motilidad bacteriana o para favorecer el crecimiento microaerófilo.
  • Líquidos (caldos): No contienen agentes solidificantes. El crecimiento se observa por turbidez, formación de película o sedimento.
• Medios de doble fase: Combinan una fase sólida y una líquida en el mismo recipiente (ej. medio de Castañeda para hemocultivos).

Técnica General para la Preparación de Medios de Cultivo

La preparación de medios de cultivo requiere seguir una serie de pasos cuidadosos para asegurar su esterilidad y correcta composición:

1. Pesado: Pesar cuidadosamente los componentes individuales o el medio deshidratado comercial. Utilizar un vidrio de reloj o un vaso de precipitado limpio y seco, según la cantidad.
2. Adición de agua: Añadir el volumen necesario de agua destilada o desionizada, según especifique la fórmula.
3. Disolución: Disolver los componentes en el agua, agitando y, si es necesario, calentando suavemente hasta la ebullición (especialmente para medios con agar). Mantener la ebullición durante 1 o 2 minutos, agitando constantemente para asegurar la completa disolución y evitar que el agar se queme en el fondo.
4. Ajuste de pH: Comprobar el pH del medio utilizando un pHmetro o papel indicador. Si hay variación respecto al valor deseado especificado en la fórmula, ajustarlo cuidadosamente añadiendo pequeñas cantidades de soluciones ácidas (ej. HCl 0.1N) o básicas (ej. NaOH 0.1N). Este paso se realiza antes de la esterilización.
5. Envasado para esterilización: Verter el medio en los recipientes finales (ej. matraces, botellas, tubos) o en un recipiente mayor si se va a distribuir después. No llenar los recipientes más de 2/3 de su capacidad para evitar derrames durante la esterilización. Tapar los recipientes adecuadamente (tapones de rosca flojos, capuchones de algodón, papel de aluminio).
6. Esterilización: Esterilizar el medio, comúnmente mediante autoclave a 121 °C durante 15-20 minutos, aunque el tiempo y la temperatura pueden variar según el volumen y la composición del medio. Algunos componentes termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden asépticamente al medio base ya esterilizado y enfriado.
7. Distribución aséptica (si aplica): Si el medio se esterilizó en un recipiente grande, dejarlo enfriar a una temperatura manejable (aprox. 45-50 °C si contiene agar, para evitar que solidifique prematuramente) y distribuirlo asépticamente en recipientes estériles individuales (placas de Petri, tubos, etc.) en una cabina de flujo laminar o cerca de un mechero Bunsen.
   • Al distribuir en placas de Petri, flamear la boca del recipiente que contiene el medio antes y después de verterlo. Tapar rápidamente las placas y homogeneizar la distribución del agar mediante movimientos suaves de rotación sobre una superficie horizontal. Es crucial mantener las placas destapadas el menor tiempo posible para evitar la contaminación.
   • Procurar no verter el agar demasiado caliente para minimizar la condensación en la tapa de la placa.
   • Si se trasvasa a tubos, realizar la operación de la manera más aséptica posible.
   • La cantidad de medio a depositar en cada recipiente dependerá del uso al que se destine (ej. 15-20 ml para una placa de Petri estándar).
8. Enfriamiento y solidificación: Dejar que los medios con agar se enfríen y solidifiquen a temperatura ambiente en una superficie horizontal. Si se preparan tubos de agar inclinado (slants), colocarlos en la posición adecuada para que el agar solidifique con la inclinación deseada.
9. Etiquetado: Etiquetar claramente cada lote de medios con el nombre del medio, fecha de preparación, número de lote y cualquier otra información relevante (ej. iniciales del preparador).
10. Conservación: Conservar los medios preparados en el frigorífico (generalmente a 2-8 °C) en la oscuridad para evitar la degradación de componentes fotosensibles. Las placas suelen almacenarse invertidas para evitar que el agua de condensación caiga sobre la superficie del agar. Asegurarse de que estén bien tapados para evitar la desecación.
11. Atemperado: Antes de su utilización, sacar los medios del frigorífico y dejarlos alcanzar la temperatura ambiente del laboratorio. Esto evita el shock térmico a los microorganismos al inocular y reduce la condensación.
12. Control de calidad y desecación de placas (si es necesario): Inspeccionar los medios antes de usar para detectar signos de contaminación o deterioro. Si las placas presentan exceso de agua de condensación en la superficie del agar, pueden secarse ligeramente (con la tapa entreabierta) en una estufa de cultivo (30-37°C por unos minutos) o en una cabina de flujo laminar antes de la siembra.