Mecanismo de ARN de Interferencia (ARNi) y su Uso en la Resistencia Viral de Plantas
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Fundamentos y Mecanismo del ARN de Interferencia (ARNi)
La tecnología de ARN de interferencia se fundamenta en el mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional, un proceso esencial presente en la mayoría de los organismos eucariontes.
El ARNi como Mecanismo de Defensa y Regulación
Es una forma de defensa celular que consiste en la síntesis de pequeños ARN de hebra simple (*siRNAs*) que logran reconocer genes foráneos y silenciarlos, ya sea mediante la metilación del ADN o la degradación del ARN mensajero (*ARNm*) antes de la traducción. Así como también, es un mecanismo crucial de regulación de la expresión propia de genes mediante los *microRNAs* (*miRNAs*), por ejemplo, degradando o evitando la expresión del gen.
Proceso Molecular del Silenciamiento Génico
El mecanismo es desencadenado dentro de las células por ARN de doble hebra (*dsRNA*). Esto activa la expresión endógena de la enzima Ribonucleasa III (*DICER*), ubicada en el citoplasma. Al encontrarse el *dsRNA* con la enzima *DICER*, esta los corta en fragmentos pequeños e iguales de 21 nucleótidos.
Estos fragmentos son tomados por la proteína AGO y forman, junto con otras proteínas, el Complejo de Silenciamiento Inducido por ARN (RISC). El complejo RISC desaparea el *dsRNA*, quedando solo la hebra *sentido* que identifica el *ARNm* con secuencias homólogas y lo degrada, evitando la expresión del gen al cual correspondía ese *ARNm*.
Aplicación del ARNi: Desarrollo de Plantas Resistentes a Virus
El ARN de interferencia es una herramienta biotecnológica poderosa para conferir resistencia a patógenos en cultivos. A continuación, se detalla el proceso metodológico para obtener plantas resistentes a virus mediante ARNi:
- Secuenciación e Identificación: Secuenciar el virus de interés e identificar el gen que se desea silenciar para evitar un ataque viral exitoso.
- Aislamiento del gen de interés.
- Construcción Genética de ARNi: Armar la construcción genética de ARNi (secuencia sentido, intrón, secuencia antisentido).
- Clonamiento en un vector de transformación de plantas.
- Transformación genética utilizando la bacteria *Agrobacterium tumefaciens*.
- Regeneración de líneas transgénicas T0.
- Verificación molecular de la presencia del transgén.
- Ensayos para determinar la resistencia al virus y seleccionar las líneas resistentes.