Manual de Laboratorio y Bioquímica Metabólica

Reglas de Laboratorio

1. Conocer la ubicación de los elementos de seguridad: matafuegos, lavaojos, salida de emergencia.
2. No guardar comida ni medicamentos en el laboratorio ni en la heladera.
3. Vestimenta apropiada, pelo atado.
4. Orden y limpieza.
5. Lavado de manos.
6. Uso de guantes y evitar tocar el celular, lápiz o apuntes.
7. No pipetear con la boca.
8. Usar anteojos de seguridad; evitar lentes de contacto.
9. No bloquear salidas de emergencia.
10. Uso de mascarillas descartables (polvos, aerosoles).
11. Manipular sustancias que produzcan humo o gases bajo campana.
12. El laboratorio debe tener botiquín.
13. Todo producto químico debe considerarse potencialmente peligroso.
14. Rotular tubos y materiales.

Aminoácidos (AA)

Clasificación por Polaridad

Apolares (en orden creciente de apolaridad):

• Alanina
• Valina
• Leucina
• Prolina
• Isoleucina
• Metionina
• Triptófano
• Fenilalanina

Polares (en orden decreciente de polaridad):

• Ácidos: Aspártico, Glutámico
• Básicos: Arginina, Lisina, Histidina
• Neutros: Glicina, Serina, Cisteína, Treonina, Asparragina, Glutamina, Tirosina

Cromatografía

Técnica de separación de aminoácidos (AA) según su polaridad. La fase móvil (fluido) arrastra la muestra a través de la fase estacionaria (sólida o líquida fijada a un sólido). En la cromatografía de adsorción, la fase estacionaria es sólida (placa de sílica gel) y la fase móvil es una mezcla de solventes. El revelador es ninhidrina en metanol absoluto.

Electroforesis

Técnica para separar macromoléculas (proteínas) de una mezcla mediante un campo eléctrico, generando zonas bien diferenciadas. Permite análisis cualitativos y cuantitativos. Se basa en la migración de partículas cargadas en un medio al aplicar una diferencia de potencial. La velocidad de migración depende de la carga neta y la resistencia al movimiento (tamaño y forma).

Factores que influyen en la movilidad:

1. Fuerzas: Actúan la fuerza eléctrica y la fuerza de resistencia. La velocidad depende de la carga y el coeficiente de fricción.
2. pH: El buffer de barbital (pH 8.6) no precipita ni desnaturaliza las proteínas, confiriéndoles carga negativa, migrando hacia el ánodo (+).
3. Peso molecular y forma: Proteínas globulares (más grandes) tienen menor movilidad que las fibrosas.
4. Carga y conformación: Las proteínas son anfóteras. En medio ácido, adquieren carga (+); en medio alcalino, carga (-). En el punto isoeléctrico, la carga es 0 y no migran.
5. Atmósfera iónica y potencial Z.
6. Electrolitos.
7. Conductividad.
8. Efecto electroendosmótico.
9. Medios de soporte: Clase 1 (separan por carga neta) y Clase 2 (separan por tamaño y carga). El soporte no debe interactuar con la muestra ni con el medio, debe ser estable, permitir la detección y, preferiblemente, controlar su reticulación (diámetro del poro).

Desarrollo del Trabajo Práctico (Electroforesis)

Se utilizan tiras de acetato de celulosa, con bajo efecto endosmótico y buena resolución. Se conservan en metanol, se secan y se equilibran en buffer de corrida (15 min). El buffer (pH superior al punto isoeléctrico) confiere carga (-) a las proteínas, que migran hacia el ánodo (+). Se siembra cerca del cátodo (-). El voltaje (2.5-3 mA por tira) y el tiempo (1 h) dependen de las proteínas. Se utiliza rojo ponceau (metanol:H₂O:acético, 45:45:10) como colorante y la misma mezcla como decolorante.

Materiales:

• Muestra: Suero humano
• Soporte: Acetato de celulosa
• Buffer: Borato de sodio (pH 8.6)
• Cuba electroforética y fuente de poder
• Colorante: Rojo ponceau

Zimogramas en Geles PAGE No Desnaturalizantes

Se evita el exceso de voltaje (calor) y voltajes bajos (difusión). Las proteínas mantienen su conformación nativa, interacciones y actividad biológica. La separación se basa en masa y carga intrínseca.

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)

Formados por polimerización de acrilamida y N,N-metilenbisacrilamida. Iniciada por persulfato de amonio (APS) y catalizada por TEMED. El SDS (dodecil sulfato de sodio) desnaturaliza las proteínas, confiriéndoles carga (-) y separándolas por peso molecular.

Electroforesis Continua vs. Discontinua

En la continua, el buffer y el pH son constantes. En la discontinua, se usa un gel concentrador (pH 6.8, apila y concentra proteínas) y un gel separador (pH 8.8). El buffer del cátodo es Tris-glicina (pH 8.3).

Preparación del Gel

Separador: Ensamblar placas, marcar límite 1 cm antes del peine. Preparar 13 mL de gel separador al 12%. Concentrador: Preparar gel al 4%.

Detección de Lacasa

1. Fijar el gel (5 min) en solución de fijación (metanol 40%, ácido acético 10%).
2. Sumergir en solución de DMP (sustrato) en buffer pH 3.5. Bandas naranjas indican lacasa.

Regulación Bioquímica de Purinas y Pirimidinas

Purinas: PRPP sintetasa, PRPP amidotransferasa (enzima control). Inhibición por producto final. GTP activa síntesis de AMP, ATP activa síntesis de GMP. Pirimidinas: Carbamil fosfato sintetasa, aspartato transcarbamilasa. Inhibición por producto final.

Combustibles Metabólicos

Glucosa, ácidos grasos, cuerpos cetónicos, aminoácidos, lactato. Fuentes menores: glicerol, pentosas. G-6-P: glucólisis, glucogénesis, vía de las pentosas fosfato. Piruvato: glucólisis, lactato, alanina. Acetil-CoA: ciclo de Krebs, síntesis de lípidos, colesterol, cuerpos cetónicos.

Regulación de Rutas Metabólicas

Puntos de control en reacciones irreversibles. Control alostérico (rápido) y por modificación covalente (más duradero). Retroinhibición, activación adelantada (control fino). Control grueso (transcripción). Regulación hormonal (insulina, glucagón, adrenalina). Compartimentalización celular. Especialización metabólica de tejidos (hepático, muscular, adiposo).