Innovación en Cultivos Celulares 3D y Producción de Bioterapéuticos

Cultivos Celulares: De 2D a 3D

Los cultivos celulares se han realizado tradicionalmente en dos dimensiones (2D), pero la creciente necesidad de obtener resultados más fisiológicamente relevantes ha llevado al desarrollo de cultivos tridimensionales (3D). Estos últimos intentan imitar de manera más realista el complejo entorno celular in vivo, lo cual es esencial para el comportamiento celular.

Cultivos Celulares 2D: Ventajas y Limitaciones

Ventajas

• Bajo coste económico: Su mantenimiento es sencillo y económico.
• Facilidad de uso: Técnicamente accesibles, incluso para laboratorios con recursos limitados.
• Análisis directo: Los resultados son fácilmente analizables.
• Técnica establecida: Existe una extensa literatura que permite comparar resultados y establecer nuevos protocolos.

Limitaciones

• Monocultivo celular: No recrean la arquitectura tisular ni las interacciones célula-célula o célula-MEC.
• Acceso homogéneo a nutrientes: En 2D, las células tienen acceso uniforme a componentes del medio, lo cual no refleja la heterogeneidad de un tejido real.
• Resultados no traslacionales: Los modelos 2D pueden proporcionar resultados que no reflejan el comportamiento in vivo, lo que contribuye al fracaso de muchos ensayos clínicos (hasta un 80% en fases II o III).
• Alteración de fenotipo y fisiología celular: Numerosos estudios indican que los cultivos 2D alteran la morfología y fisiología celular en comparación con condiciones in vivo.

Cultivos Celulares 3D: Modelos Más Avanzados

Los cultivos 3D ofrecen un entorno celular más realista al considerar la arquitectura tridimensional y la composición de la Matriz Extracelular (MEC). Estos modelos permiten observar interacciones célula-célula y célula-MEC que son fundamentales para replicar procesos como diferenciación, proliferación, apoptosis y respuesta a fármacos.

Matriz Extracelular (MEC) y su Importancia

La MEC es una red dinámica de macromoléculas (glicoproteínas, proteoglicanos y glucosaminoglucanos) que brinda soporte estructural y regula funciones celulares clave como señalización, proliferación y migración. Alteraciones en la MEC están asociadas a patologías como fibrosis, inflamación o cáncer.

Modelos 3D Basados en Soportes Artificiales

Andamiajes Artificiales (Scaffolds)

Estos soportes sintéticos proporcionan un ambiente similar a la MEC para la adhesión y proliferación celular. Se fabrican mediante técnicas como:

• Liofilización: Congela soluciones poliméricas para crear soportes porosos, pero presenta variabilidad en la rigidez.
• Impresión 3D: Incluye modelado por deposición fundida, electrohilado y estereolitografía. Permite controlar parámetros como el diámetro de las fibras, pero algunos polímeros pueden ser tóxicos o reducir la adhesión celular.

Tabla 1. Ventajas y desventajas de los soportes 3D que emplean polímeros artificiales para el cultivo celular.

Geles e Hidrogeles

Los geles y hidrogeles son matrices de polímeros entrelazados que forman redes tridimensionales inmersas en un fluido, generalmente agua. Están compuestos por uno o varios polímeros, unidos mediante interacciones físicas, iónicas o covalentes, que se entrecruzan tridimensionalmente formando redes inmersas en un fluido.

• Colágeno tipo I: Imitación fisiológica adecuada, pero con problemas de contracción y rigidez insuficiente.
• Matrigel: Gel derivado de matriz tumoral, con variabilidad entre lotes.
• Otros geles: Fibrina (reparación tisular), ácido hialurónico (cultivo de condrocitos) y alginato (biocompatibilidad).
• Geles de matriz tisular humana: Desarrollados a partir de tejido mamario, permiten un enfoque más realista y personalizado.

Ventajas:

• Alta biocompatibilidad.
• Entorno viscoelástico similar al nativo.
• Permiten proliferación y diferenciación controladas.

Desventajas:

• Variabilidad de lotes en Matrigel.
• Dificultad para replicar toda la complejidad de la MEC.

Esferoides y Tumoroides

Los esferoides son agrupaciones celulares que imitan la estructura de tumores sólidos, formando un núcleo necrótico rodeado por capas de células quiescentes y proliferativas.

• Formación: Utilizando sustratos no adhesivos o gota suspendida.
• Aplicación: Modelos de cáncer (tumoroides) que replican la migración e invasión celular.

Cultivos Dinámicos y Dispositivos Microfluídicos

Los cultivos dinámicos utilizan biorreactores con agitación para crear condiciones similares a la circulación sanguínea. Existe un tipo especial de aparatos, denominados biorreactores dinámicos, que utilizan una hélice o propulsor para crear turbulencias que permiten la agrupación celular en esferoides.

Ninguno de los métodos anteriores tiene en cuenta la dinámica de fluidos, un aspecto de importancia capital a la hora de entender, por ejemplo, cómo se distribuye un fármaco antitumoral por el sistema sanguíneo hasta llegar al tejido diana (81) o cuál es el proceso de vascularización producido en un estado metastásico (84). Por ello, con el fin de integrar estos conceptos se desarrollaron los dispositivos microfluídicos (90), que permiten manipular y controlar el flujo.

Además, los dispositivos microfluídicos permiten el estudio de procesos como:

• Angiogénesis y vascularización.
• Distribución de fármacos.
• Modelos de metástasis.

Conceptos Clave en Biotecnología y Cultivo Celular 3D

1. Matriz Extracelular (MEC) y su Influencia en las Células

La matriz extracelular (MEC) es un componente fundamental de los tejidos, compuesto por una red compleja de macromoléculas como colágeno, laminina, fibronectina, proteoglicanos y glucosaminoglucanos. Su función no se limita al soporte estructural, sino que también influye en diversas propiedades bioquímicas y biofísicas de las células. La MEC está en constante remodelación regulada por las propias células, permitiendo:

• Actuar como reservorio de factores de crecimiento y citoquinas.
• Transmitir señales mecánicas a través de receptores como las integrinas.
• Regular la adhesión, migración y proliferación celular.
• Influir en la polaridad tisular y la división celular.

2. Criodeshidratación o Liofilización y sus Tipos

La criodeshidratación o liofilización es una técnica utilizada en la fabricación de soportes tridimensionales para cultivo celular. Consiste en la congelación de una solución polimérica seguida de la eliminación del solvente por sublimación, generando una estructura porosa y sólida.

Tipos de soportes fabricados:

• Por criodeshidratación (liofilización): Ejemplos incluyen andamios de alcohol polivinílico (PVA) para cardiomiocitos, policaprolactona (PCL) para regeneración de tendones y mezclas poliméricas para implantología de tejidos blandos.
• Por fabricación aditiva:
  • Modelado por deposición fundida (FDM): Utilizado en la creación de estructuras que imitan vellosidades intestinales.
  • Electrohilado (Electrospinning): Permite fabricar soportes para el crecimiento de células madre de cáncer de mama.
  • Estereolitografía: Aplicada en la generación de guías neurales artificiales para la reparación de nervios.

3. Ventajas y Desventajas de los Soportes 3D con Polímeros Artificiales

Ventajas:

• Simulan la estructura de la MEC, favoreciendo la difusión de nutrientes y gases.
• Permiten el control de parámetros como el tamaño y el diámetro de las fibras.
• Ofrecen una amplia variedad de materiales biodegradables.

Desventajas:

• La artificialidad del material puede generar sesgos en los resultados celulares.
• Algunos polímeros pueden ser tóxicos.
• La adhesión celular es reducida en comparación con soportes naturales.
• La liofilización no siempre reproduce adecuadamente la estructura fibrilar de la MEC.

4. Matrices 3D de Colágeno Tipo I: Ventajas y Desventajas

Ventajas:

• Alta biocompatibilidad y adhesión celular.
• Proporciona un entorno viscoelástico similar al de los tejidos nativos.

Desventajas:

• Contracción significativa durante cultivos prolongados.
• Ausencia de sitios de unión específicos para ciertos factores de crecimiento.
• Dificultad para ajustar la rigidez del gel.

5. Matrigel y sus Limitaciones

El Matrigel es un gel derivado de la MEC secretada por células de sarcoma EHS, utilizado para crear un microambiente celular similar al in vivo. Sus limitaciones incluyen:

• Variabilidad entre lotes, dificultando la reproducibilidad.
• Composición compleja y no definida.
• Potencial interferencia con procesos celulares debido a factores de crecimiento tumorales.

6. Esferoides y su Estructura

Los esferoides son agrupaciones celulares que imitan la estructura de tumores sólidos, formando un núcleo necrótico rodeado por capas de células quiescentes y proliferativas. (Nota: El texto original contenía una definición de 'esteroides' como compuestos lipofílicos. Se ha corregido a 'esferoides' para mantener la coherencia con el tema de cultivos celulares 3D.)

7. Esferoides en Gotas Suspendidas

Se refiere a formulaciones en las que los esferoides se dispersan en forma de pequeñas gotas en un medio líquido, permitiendo una liberación controlada y mejor biodisponibilidad. (Nota: Se ha corregido 'esteroides' a 'esferoides' para mantener la coherencia con el tema de cultivos celulares 3D.)

8. Definición de Organoide, Tumoroide y Cultivo Dinámico

• Organoide: Modelo tridimensional derivado de células madre que reproduce aspectos funcionales y estructurales de un órgano.
• Tumoroide: Cultivo 3D de células tumorales que imita la heterogeneidad y microambiente de un tumor.
• Cultivo dinámico: Sistemas que incluyen estímulos mecánicos o flujos de fluidos para replicar condiciones fisiológicas reales.

9. Dispositivos Microfluídicos y su Uso

Son plataformas en miniatura que permiten controlar pequeños volúmenes de fluidos en canales micrométricos. Se usan en estudios celulares, cribado de fármacos y "organ-on-a-chip".

10. Matrices CDM Construidas por CAFs

Las matrices CDM (cell-derived matrix) son estructuras producidas por células, en este caso fibroblastos asociados al cáncer (CAFs). Se utilizan para estudiar la interacción célula-tumor y la respuesta a terapias anticancerígenas.

Producción de Proteínas Bioterapéuticas y Líneas Celulares

1. Ventajas sobre Fármacos de Moléculas Pequeñas

• Mayor especificidad.
• Menos interacciones no deseadas.
• Perfiles de seguridad mejorados.

2. Avances en la Ingeniería de Proteínas

• Optimización de fármacos proteicos: Se han desarrollado tecnologías para crear fármacos con:
  • Mayor potencia y especificidad.
  • Mejor estabilidad y solubilidad.
  • Farmacocinética optimizada.
• Anticuerpos monoclonales: Se producen predominantemente en células de mamíferos recombinantes y han mostrado un crecimiento continuo desde los primeros éxitos oncológicos.

3.1. Sistemas de Expresión en Mamíferos

• Uso de células de mamíferos: La mayoría de los productos bioterapéuticos se producen en células de mamíferos cultivadas.
• Células CHO (Ovario de Hámster Chino): Representan entre el 60% y 70% de los productos biológicos recombinantes comercializados.
  • Ventajas de las células CHO: Capacidad para el plegamiento, ensamblaje y modificación postraduccional adecuados de las proteínas. Cultivo en suspensión para escalado industrial. Expresión en medios sin suero y químicamente definidos. Menor riesgo de propagar virus humanos.

3.2. Otras Líneas Celulares Utilizadas

• Líneas tradicionales:
  • Mielomas de ratón: Sp2/0 y NS0.
  • Mieloma de rata: YB2/0.
  • Células de riñón de cría de hámster (BHK).
• Líneas humanas desarrolladas recientemente: PER.C6 y CAP, diseñadas para lograr una mejor modificación postraduccional (PTM) y reducir la inmunogenicidad de las proteínas bioterapéuticas.

4. Selección y Desarrollo de Líneas Celulares Estables

• Objetivo: Seleccionar líneas celulares estables con alta productividad tras la transfección.
• Sistemas más utilizados:
  • Sistema MTX – DHFR: El metotrexato (MTX) inhibe la dihidrofolato reductasa (DHFR), permitiendo la amplificación de copias del gen de interés.
  • Sistema MSX – GS: La metionina sulfoximina (MSX) inhibe la glutamina sintetasa (GS), logrando una mayor expresión del gen.
  • Sistema CHO-Cumate: Desarrollado por el Consejo Nacional de Investigación (NRC) de Canadá, utiliza la variante CHO-DUXB11 llamada CHO-BRI, que integra de manera estable el transactivador del operador Cumate (rcTA) junto con el represor CymR.

4.2. Manipulación Genética de las Células Huésped

Se han realizado manipulaciones para optimizar:

• El metabolismo celular.
• La antiapoptosis.
• La interferencia del ciclo celular.
• La secreción de proteínas.
• La glicosilación.

Estas mejoras buscan generar mejores líneas celulares para la producción de proteínas bioterapéuticas.

5. Sistemas de Expresión y Diseño de Células

• Generar el plásmido que exprese la proteína recombinante. El plásmido debe contener todos los elementos genéticos necesarios tanto para la expresión de la proteína como para la selección de las células productivas.
• Introducir el plásmido en las células huésped.
• Seleccionar líneas celulares que mantengan altos niveles de expresión.
• Escalar la producción mediante el uso de biorreactores.

5.2. Plásmidos y Elementos de Expresión

• Origen de los plásmidos: Derivan de virus, ratones y humanos.
• Promotores utilizados:
  • Fuertes: Citomegalovirus (CMV) humano o murino. Promotores del virus simio 40 (SV40) y del virus del sarcoma de Rouse (RSV). Promotor de mantenimiento endógeno CHO-EF1α (CHEF1). Promotor inducible por cumato CR5, que tiene una expresión más alta que el CMV.
  • Débiles: Se utilizan para la expresión de genes marcadores de selección.
• Mejora en la transcripción: La inclusión de un intrón quimérico como potenciador en la transcripción primaria conduce a una expresión más estable de la proteína recombinante, mejorando el transporte y procesamiento del ARNm desde el núcleo hasta el citoplasma.

6. Métodos de Administración de ADN (Transfección)

• Definición: La transfección es el proceso mediante el cual se administran ácidos nucleicos extraños a las células.
• Requisitos para un buen método:
  • Alta eficiencia de transfección.
  • Baja toxicidad celular.
  • Mínimos efectos sobre la fisiología normal de las células.
• Métodos utilizados:
  • Biológicos: Uso de vectores virales para la administración de ADN.
  • Químicos: Reactivos catiónicos como fosfato de calcio, lípidos y polímeros.
  • Físicos: Inyección directa con microagujas. Magnetofección con nanopartículas magnéticas. Electroporación (método de elección para la fabricación industrial de líneas celulares).
• Eficiencias de transfección: Pueden variar entre el 5% y el 100% según la línea celular y el método.

7. Sistemas de Amplificación

• Propósito: Incrementar el número de copias del gen de interés en las células para lograr altos títulos de proteína.
• Métodos:
  • Sistema DHFR/MTX: La adaptación de células recombinantes a concentraciones elevadas de MTX conduce a eventos de amplificación cromosómica, aumentando el número de copias del gen DHFR.
  • Sistema GS/MSX: De forma similar, la exposición a MSX amplifica el gen GS.
• Resultado: Líneas celulares de fabricación con altos niveles de producción.

8. Identificación de Células Clonales de Alta Expresión

• Importancia: La identificación de células con alta productividad dentro de grupos de células transfectadas es crítica para el desarrollo exitoso de líneas celulares.
• Métodos de selección: Se requieren técnicas eficaces para facilitar la búsqueda y el aislamiento de clones altamente productivos.

9. Estabilidad Celular

• Desafíos: Con el paso de múltiples pases celulares, las propiedades de una línea celular pueden cambiar, pudiendo perder la expresión deseada o generar proteínas no deseadas.
• Requisitos: Caracterizar y controlar la estabilidad de las características deseadas a lo largo de la producción a gran escala. Establecer un número máximo de pases para comparar las propiedades de las células en ensayos de corta y larga duración.

10. Cultivo en Biorreactores

• Objetivo: Proporcionar un entorno estéril, con adecuada mezcla, y control de parámetros críticos (temperatura, pH y oxígeno disuelto) para el cultivo de células de mamíferos en suspensión.