Inmovilización de enzimas: ventajas, métodos y efectos

Inmovilización de enzimas:

Los procesos catalizados por enzimas presentan ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:

• Gran actividad catalítica
• Gran especificidad de sustrato
• Activos a temperatura y presión atmosférica

Aspectos generales:

Se localiza a la enzima en una región definida del espacio, dar lugar formas insolubles que retienen su actividad catalítica y puede ser reutilizada.

Definición:

Proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas por su unión a un soporte.

Ventajas:

• Aumento de estabilidad
• Reutilización del derivado
• Reactor de fácil manejo y control

Inconvenientes:

• Alteración de la conformación estado nativo
• Heterogeneidad del sistema enzima-soporte
• Pérdida de actividad enzimática
• Biocatalizador más caro que enzima

Tanques:

• Agitado
• Agitado y alimentado continuo
• Lecho fluidizado y alimentado continuo
• Lecho empaquetado y alimentado continuo
• Lecho empaquetado continuo y reciclado
• Agitado, alimentado continuo y recuperación por ultrafiltración

Métodos de inmovilización:

Retención física y unión química.

Retención física:

Se divide en atrapamiento e inclusión en membranas.

Atrapamiento:

Retención de la enzima en cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida por prepolímeros fotoentrecruzables.

Método:

1. Suspensión de la enzima en una solución del monómero (enzima queda atrapada en el interior de un gel)
2. Polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico (ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética)

Inclusión en membranas:

Se divide en microencapsulación y reactores de membrana.

En la microencapsulación, las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima.

En los reactores de membrana, se emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial e impermeables a la enzima.

Métodos:

1. Mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través de la membrana
2. Por contacto continuo de una solución de enzima con la membrana

Unión química:

Se divide en unión a soportes y reticulado, métodos más utilizados y de los que se dispone de una mayor información.

Finalidad: incrementar afinidad por sustrato, disminuir inhibición, pH óptimo, reducir contaminación microbiana.

Tipos de soporte:

Soportes inorgánicos: pueden ser naturales (arcillas, piedra pómez y sílice) o materiales manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado).

Soportes orgánicos: entre los naturales pueden ser polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos) y proteínas fibrosas (colágeno, queratina). Entre los sintéticos pueden ser poliolefinas y polímeros acrílicos.

Unión a soportes:

Se dividen en adsorción y unión covalente.

Adsorción:

La enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno.

Factores que influyen: pH del medio, fuerza iónica, diámetro de poro, presencia de iones.

Ventajas: preparación sencilla, bajo costo, sin cambios en especificidad enzimática.

Inconvenientes: optimización de variables, derivados mecánicamente poco estables, unión al soporte débil.

Unión covalente:

Es el método de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial.

Finalidad: se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas.

Ventajas: manipulación de derivados sencilla, carga enzimática constante después de la inmovilización, derivados pueden utilizarse en reactores continuos, mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, pH y disolventes.

Inconvenientes: necesario conocer la densidad de grupos activos ya que condiciona el número de uniones, puede alterar la estructura del centro activo, no aconsejable para enzimas sensibles a cambios de pH y fuerza iónica.

Reticulado:

Denominado entrecruzamiento o cross-linking, utilizado en la estabilización de muchas enzimas.

Finalidad: consiste en el uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima.

Resultado: enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.

Co-reticulado: permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales.

Finalidad: entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (albúmina bovina).

Efectos de la inmovilización:

Cambios en su estabilidad. Factores como pH, sustrato, productos, inhibidores, cofactores y activadores están en interfase, por lo cual la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico o del microentorno.

Efectos en la estabilidad:

Incremento en la estabilidad de las enzimas después de su inmovilización debido a una estabilización conformacional, protección frente a proteasas del medio, evita agregación intermolecular y alteración del microentorno.