Ingeniería Genética y Diagnóstico Molecular: Técnicas y Aplicaciones

Ingeniería Genética y Diagnóstico Molecular

Producción de Proteínas Recombinantes

Promotor Lac en E. coli

El promotor Lac en E. coli necesita CAP (proteína activadora de catabolitos) para su activación. La actividad de CAP depende del AMP cíclico (AMPc), que activa a CAP cuando no hay glucosa presente. Si hay lactosa o IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido), el promotor Lac se induce.

Vectores de Expresión en Eucariotas

Los vectores de expresión en eucariotas requieren:

• Origen de replicación en E. coli y marcador de selección para E. coli.
• Origen de replicación en eucariotas y marcador de selección en eucariotas.
• Promotor eucariota, sitio de clonación, codón de inicio (ATG) y señales de terminación transcripcionales y traduccionales.
• Secuencia Kozak (para la iniciación de la traducción) y secuencia de poliadenilación.

Si el vector se va a integrar en el genoma, no necesita un origen de replicación en eucariotas, pero sí una secuencia específica del hospedador para la integración.

Ventajas de Saccharomyces cerevisiae

• Organismo unicelular, bien caracterizado y fácil de cultivar.
• Dispone de varios promotores conocidos y un plásmido de 2 micras que se puede usar como vector endógeno de expresión.
• Realiza modificaciones postraduccionales.
• Secreta pocas proteínas, lo que facilita la purificación.
• Amplio historial de uso en biotecnología.

Vectores en Levaduras

• Basados en plásmidos, se usan para producir proteínas recombinantes.
• Se utilizan cepas auxótrofas para algún aminoácido.
• Poseen promotores fuertes y conocidos.
• Suelen tener un terminador del mismo gen que el promotor.
• Se puede clonar un péptido señal en proteínas exógenas para su secreción.
• Se pueden crear proteínas de fusión para mejorar la producción.
• En ocasiones, el vector se integra en el cromosoma.

Baculovirus

• Se utiliza para producir proteínas recombinantes en células de insecto.
• La nucleocápside individual puede infectar células adyacentes.
• El poliedro es un grupo de nucleocápsides atrapadas en una matriz.
• Los poliedros se liberan al ambiente al morir el insecto.
• Al ser ingeridos, los viriones entran en las células del intestino y sintetizan poliedrina hasta que rompen las células y matan al insecto.
• Se produce un baculovirus recombinante coinfectando células de insecto con el ADN del baculovirus silvestre cortado y un vector con el ADN de interés.
• Los recombinantes se distinguen por PCR.
• Se sustituye un gen no esencial por el gen de interés.

Animales Transgénicos

Un animal transgénico tiene un fragmento de ADN exógeno integrado en su genoma que codifica proteínas de interés.

Métodos para obtener animales transgénicos:

• Inyección pronuclear: Se inyectan varias copias del transgén en un pronúcleo del óvulo recién fecundado.
• Transferencia nuclear: Se transfiere el núcleo de una célula somática transformada con el transgén integrado a un óvulo al que se le ha extraído el núcleo.

Test Genético

Fenilcetonuria

La fenilcetonuria es una deficiencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa, que impide la conversión de fenilalanina a tirosina. El gen mutado es recesivo autosómico y causa daño cerebral en bebés. El test de Guthrie se utiliza para detectar la enfermedad.

Tipos de Test Genéticos

• Hibridación con sonda específica
• Secuenciación
• PCR
• Microarrays

Técnicas de Biología Molecular

Método PCR/OLA (Oligonucleotide Ligation Assay)

Se utiliza para determinar si un genotipo es mutante o silvestre. Se diseñan oligonucleótidos complementarios a la secuencia silvestre y mutante, marcados con biotina y digoxigenina, respectivamente. Si hay complementariedad, los oligonucleótidos se unen mediante una ligasa. La detección se realiza mediante estreptavidina y un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina.

Método LCR (Ligase Chain Reaction)

Similar al PCR/OLA, pero utiliza una ligasa termoestable y ciclos de temperatura para la ligación y desnaturalización. La presencia de producto de ligación se visualiza en un gel de electroforesis.

Sonda con Candado

Esta técnica utiliza una sonda que se cierra o "bloquea" sobre la secuencia diana, permitiendo una detección específica.

Detección de Mutaciones por PCR con Oligonucleótidos Fluorescentes

Se utilizan oligonucleótidos marcados con fluoróforos que hibridan con la secuencia silvestre o mutante. La fluorescencia emitida indica la presencia de la mutación.

ADN Fingerprinting

Detecta diferencias entre individuos de la misma especie basándose en el número de repeticiones en regiones de microsatélites o minisatélites.

Tipos de Alteraciones del ADN

• Mutación
• Polimorfismo
• SNP (polimorfismo de un solo nucleótido)
• Inestabilidad de microsatélites
• Pérdida alélica o de heterocigosidad
• Amplificación de un gen
• Aumento/disminución de la expresión de genes
• Aberraciones cromosómicas

Tipos de Análisis de Diagnóstico Genético

Detección de Secuencias Específicas

Ejemplo: detección de ADN del parásito de la malaria mediante hibridación.

Detección de Mutaciones Simples y SNP

Ejemplos: fibrosis quística (gen CFTR) y anemia falciforme.

Test Citogenéticos

Identifican mutaciones de gran tamaño. Incluye la técnica FISH (hibridación in situ fluorescente).

Análisis Epigenéticos

Detectan cambios en la expresión génica, como la metilación del ADN. Ejemplo: técnica MSP (Methylation-Specific PCR).

Ventajas y Desventajas de los Test Genéticos

Ventajas

• Requiere una cantidad mínima de muestra.
• Elevada especificidad analítica.
• Parcialmente automatizable.
• Rápido en comparación con métodos clásicos.
• A veces es la única técnica disponible.

Desventajas

• Requiere conocimientos especializados.
• Técnica compleja.
• Necesidad de verificar la fiabilidad y utilidad de la diana.
• Equipamiento específico y áreas de trabajo separadas.