Ingeniería Genética: ADN Recombinante, PCR, Electroforesis y Técnicas de Hibridación

ADN recombinante: Es una molécula de ADN artificial formada por la unión de dos segmentos de ADN de distintos organismos que no se unirían de forma natural. Para lograrlo, se necesita aislar el gen que se quiere introducir, insertarlo en un plásmido y luego insertar este ADN en el nuevo organismo.

Enzimas de Restricción y Ligación

Las enzimas de restricción cortan el ADN. Hay dos tipos principales:

• Tipo I: Cortan aleatoriamente.
• Tipo II: Reconocen secuencias específicas (palindrómicas) y cortan en esos sitios.

Además, los cortes generados por las enzimas de restricción pueden ser:

• Extremos romos: Sin borde sobresaliente, requieren modificación para unirse.
• Extremos cohesivos: Con secuencia sobresaliente, no requieren modificación para unirse.

La enzima ligasa une los extremos de forma covalente, formando así la molécula de ADN recombinante.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR es una técnica para generar muchas copias idénticas de ADN mediante polimerización en cadena. Los pasos son:

1. Desnaturalización: Se separan las dos hebras de ADN a 95 grados durante 15 segundos, convirtiéndolas en cadenas simples.
2. Apareamiento: Los primers se unen a las hebras en lugares específicos debido a la complementariedad de sus bases.
3. Extensión: La polimerasa extiende los primers y sintetiza nuevas cadenas de ADN.

Los reactivos necesarios incluyen: ClMg, cofactores, la polimerasa, un buffer (solución amortiguadora) y adyuvantes.

La PCR se realiza en un termociclador, donde se coloca un tubo con los reactivos. Se configura el número de etapas y, al finalizar, se siembra en agarosa.

Electroforesis

La electroforesis es una técnica para separar moléculas por tamaño y forma, según su velocidad de movimiento bajo la influencia de un campo eléctrico.

Pasos:

1. Se utiliza un gel de agarosa que forma una matriz porosa.
2. El ADN, cargado negativamente, se coloca en el gel y migra hacia el polo positivo. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápido.
3. Se añaden marcadores de frente (colorantes) que migran según el tamaño para indicar cuándo detener la corrida.
4. En otra calle del gel, se coloca un marcador de peso molecular para conocer el tamaño de las moléculas.
5. Finalmente, se revela el gel con bromuro de etidio y se expone a luz UV.

Southern Blot

El Southern blot se utiliza para identificar un gen de interés en una mezcla compleja de ácido nucleico.

Pasos:

1. Desnaturalización: El ADN clonado se corta y separa por electroforesis. El gel se trata con NaOH para romper las uniones entre las dos cadenas.
2. Transferencia: El ADN se transfiere a una membrana de nitrocelulosa, donde se inmoviliza.
3. Hibridación: El producto del Southern blot se hibrida con una sonda de ADN que marca el gen de interés.
4. Revelado: Se coloca la sonda con rayos X en una caja que aísle la luz para registrar dónde hay desintegración radioactiva.

Vectores de Clonación

Un vector es una molécula de ADN que transporta un gen de interés de un organismo a otro. Debe poder replicarse por sí solo con el ADN que transporta, tener un sitio de corte y ser fácil de recuperar.

Los vectores de clonación se utilizan para transportar un gen y generar copias dentro de la célula.

Vectores de Expresión

Los vectores de expresión se utilizan para expresar la información de un gen y transformarla en proteína. Deben tener un promotor, un sitio de terminación, un sitio de unión a ribosomas y una señal de poliadenilación.