Identificación de Enterobacterias: Pruebas Bioquímicas Clave

Pruebas Bioquímicas para la Identificación Bacteriana

Pruebas Primarias

• Fermentación de glucosa (medio de Hugh-Leifson)
• Fermentación de lactosa (agar MacConkey)
• Prueba de la oxidasa

Pruebas Secundarias

• Pruebas IMViC
• Prueba en agar de hierro de Kligler (KIA/TSI)
• Prueba de la ureasa

Prueba de la Oxidasa

Esta prueba determina la presencia o ausencia de la enzima citocromo-oxidasa en los microorganismos.

Fundamento

En presencia de oxígeno atmosférico, la enzima intracelular citocromo-oxidasa oxida el reactivo (fenilendiamina), formando un compuesto de color púrpura llamado indofenol. El reactivo se presenta comúnmente en tiras de papel absorbente con una zona reactiva.

Procedimiento

1. Depositar una colonia de un cultivo fresco (18-24 h) sobre la zona reactiva de la tira.
2. Frotar la colonia sobre la zona reactiva con el asa de siembra.
3. Esperar entre 10 y 30 segundos para efectuar la lectura.

Lectura de Resultados

• Positivo: La zona reactiva se colorea de azul a violeta oscuro.
• Negativo: La zona reactiva presenta un color rosado o no hay cambio de color.

Pruebas IMViC

Son un conjunto de cuatro pruebas que se realizan de forma independiente pero que, por lo general, se interpretan en conjunto con la prueba en el medio Kligler. Constituyen el método de rutina para la identificación bioquímica de enterobacterias.

El acrónimo IMViC significa:

• I: Indol
• M: Rojo de Metilo (Methyl Red)
• V: Voges-Proskauer
• C: Citrato

Prueba del Indol

Determina la capacidad de un microorganismo para producir indol a partir del aminoácido triptófano, gracias a la presencia de la enzima triptofanasa.

Fundamento

El indol se detecta mediante el reactivo de Kovacs, que, en su presencia, forma un compuesto de color rosa intenso o rojo en la superficie del cultivo.

Procedimiento

1. Inocular una o dos colonias en caldo triptófano o peptona.
2. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C.
3. Añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs, dejándolas resbalar por la pared interior del tubo.

Lectura de Resultados

• Positivo: Aparición de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y el cultivo.
• Negativo: El reactivo permanece de color amarillo.

Prueba del Rojo de Metilo (RM)

Determina la capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables productos ácidos como resultado final de la fermentación ácido-mixta de la glucosa.

Fundamento

Se utiliza el indicador de pH Rojo de Metilo, que tiene un intervalo de viraje entre amarillo (pH > 6) y rojo (pH < 4.4).

Procedimiento

1. Inocular una o dos colonias en caldo MRVP (caldo para Rojo de Metilo y Voges-Proskauer).
2. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C.
3. Añadir 5 gotas del indicador Rojo de Metilo por cada 5 ml de cultivo.

Lectura de Resultados

• Positivo: El medio adquiere un color rojizo.
• Negativo: El medio permanece de color amarillo.

Prueba de Voges-Proskauer (VP)

Determina la capacidad de un microorganismo para fermentar la glucosa por la vía butanodiólica, produciendo acetoína como intermediario.

Fundamento

En un medio alcalino y en presencia de oxígeno, la acetoína se oxida a diacetilo. Este compuesto reacciona con el alfa-naftol (indicador de color), dando lugar a un color rosa fucsia o rojo.

Procedimiento

1. Inocular una o dos colonias en caldo MRVP e incubar durante 24-48 horas a 37 °C.
2. Transferir 1 ml del cultivo a un tubo limpio y añadir 12 gotas de alfa-naftol al 5% en etanol y 4 gotas de KOH al 40%.
3. Agitar suavemente y esperar de 10 a 15 minutos.

Lectura de Resultados

• Positivo: El medio adquiere un color rojo-fucsia.
• Negativo: El medio permanece de color amarillo.

Prueba del Citrato

Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el citrato como única fuente de carbono y energía.

Fundamento

Se utiliza el Agar Citrato de Simmons, que contiene citrato de sodio como única fuente de carbono y azul de bromotimol como indicador de pH. Si el microorganismo utiliza el citrato, alcaliniza el medio, haciendo que el indicador vire de verde a azul.

Procedimiento

1. Inocular una o dos colonias mediante el método de estría en la superficie del agar inclinado.
2. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C.

Lectura de Resultados

• Positivo: Se observa crecimiento en la superficie y el medio cambia de color a azul intenso.
• Negativo: No se observa crecimiento ni cambio de color (el medio permanece verde).

Prueba en Agar Hierro de Kligler (KIA)

Procedimiento

1. Inocular el microorganismo sembrando por estría en la superficie inclinada y por picadura en la parte profunda del medio.
2. Incubar durante 18-24 horas a 37 °C.

Interpretación de Resultados

Este medio permite evaluar la fermentación de glucosa y lactosa, así como la producción de gas y de sulfuro de hidrógeno (H₂S).

• Producción de gas: Se detecta por la formación de burbujas visibles que agrietan o desplazan el medio de cultivo.
• Producción de H₂S: Se detecta por la aparición de un precipitado negro de sulfuro de hierro, formado por la reacción del H₂S con las sales de hierro presentes en el medio. Este ennegrecimiento suele observarse en el fondo del tubo.

Posibles resultados:

• 1. Glucosa (+), Lactosa (-), Gas (+), H₂S (-)
• 2. Glucosa (+), Lactosa (-), Gas (+/-), H₂S (-)
• 3. Glucosa (+), Lactosa (-), Gas (-), H₂S (+)
• 4. Glucosa (-), Lactosa (-), H₂S (-), Gas (-)

Interpretación de los tubos:

• Tubo 1 (completamente amarillo): Fermenta glucosa y lactosa (pico y fondo amarillos). Sin producción de H₂S ni gas.
• Tubo 2 (pico rojo, fondo amarillo): Fermenta solo glucosa (fondo amarillo), pero no lactosa (pico rojo/alcalino). Sin producción de H₂S ni gas.
• Tubo 3 (pico rojo, fondo negro): Fermenta solo glucosa (el fondo sería amarillo si no estuviera enmascarado por el precipitado negro). No fermenta lactosa (pico rojo). Produce H₂S (precipitado negro).
• Tubo 4 (completamente rojo): No fermenta ni glucosa ni lactosa (pico y fondo rojos/alcalinos). Sin producción de H₂S.

Prueba de la Ureasa

Determina la capacidad de un microorganismo para degradar la urea mediante la enzima ureasa. Esta reacción libera amoníaco, lo que alcaliniza el medio.

Fundamento

Para detectar la reacción se utiliza un indicador de pH como el Rojo de fenol. Los medios más comunes son el Agar urea de Stuart y el Agar urea de Christensen, preparados en tubo inclinado. Esta reacción es característica de Proteus spp. y se utiliza para diferenciarla de otras enterobacterias.

Medios de Cultivo Selectivos y Diferenciales

Agar MacConkey

Características

• Selectivo: Contiene sales biliares y cristal violeta, que inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas, favoreciendo el crecimiento de bacterias Gram negativas, especialmente enterobacterias.
• Diferencial: Permite diferenciar bacterias que fermentan lactosa de las que no. El indicador de pH es el rojo neutro. Si la bacteria fermenta lactosa, produce ácidos que bajan el pH, y las colonias viran a un color rosa o rojo. Si no fermenta lactosa, las colonias permanecen incoloras.

Resultados Típicos

• Escherichia coli: Colonias rosas, ya que fermenta lactosa.
• Enterobacter aerogenes: Colonias rosas, también fermenta lactosa.
• Proteus vulgaris: Colonias incoloras, no fermenta lactosa.
• Salmonella typhimurium: Colonias incoloras, no fermenta lactosa.
• Staphylococcus aureus: No crece o su crecimiento es muy escaso, por ser una bacteria Gram positiva.

Agar SS (Salmonella-Shigella)

Características

• Selectivo: Contiene sales biliares y verde brillante, que inhiben a las bacterias Gram positivas y a muchas Gram negativas no entéricas, pero permite el crecimiento de Salmonella, Shigella y Proteus spp.
• Diferencial: Diferencia bacterias según la fermentación de lactosa y la producción de sulfuro de hidrógeno (H₂S).

Resultados Típicos

• Fermentación de lactosa: Las bacterias que fermentan lactosa (ej. E. coli) acidifican el medio y producen colonias rojas o rosadas.
• Producción de H₂S: Las bacterias que producen H₂S (ej. Salmonella, Proteus) forman colonias con un centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro.
• Escherichia coli: Colonias rojas (fermenta lactosa).
• Salmonella: Colonias incoloras (no fermenta lactosa) con un centro negro (produce H₂S).
• Shigella: Colonias incoloras (no fermenta lactosa ni produce H₂S).