Identificación de Bacilos Entéricos Gram-negativos y Virotipos de E. coli

KIA: diferenciar los bacilos entéricos Gram-negativos

en base a cuatro características:

1. Su capacidad de fermentar la lac y/o la glc
2. Capacidad de producción de gas de aquellos microorganismos fermentadores de azúcares.
3. Capacidad de algunos microorganismos de producir Hidrógeno Sulfuro.
4. Conocer su Metabolismo respiratorio: permite diferenciar entre aerobios/anaerobios facultativos y anaerobios estrictos.

Es un medio sólido de color anaranjado (tubo-agar inclinado)

Podemos ver crecimiento aerobio en el pico de flauta y crecimiento anaerobio en la profundidad del tubo. La siembra se hace con una colonia aislada con siembra en picadura hasta el fondo del tubo y después sobre la zona del pico de flauta. El medio se debe incubar sin taparlo del todo para no evitar el crecimiento aerobio. Contiene 2 carbohidratos, lactosa y glucosa, además de un indicador de pH (Rojo fenol). También está compuesto por peptonas (utilizadas en primer lugar por el microorganismo si no fermenta azúcares, o bien, una vez agotados los azúcares). También permite la observación de producción de gas: se rompe el medio, aparecen burbujas o puede haber hasta desplazamiento del medio. Producción de H₂S: ennegrecimiento del medio o precipitado en el fondo del tubo.

ESCHERICIA COLI: más de 150 serogrupos O somático y más de 56 antígenos H

Se ha propuesto para E. coli una clasificación de acuerdo a sus mecanismos de virulencia, los llamados virotipos. Se describen 5 virotipos.

1. E. coli enterotoxigénico (ETEC): Se parece mucho a V. Cholerae; la enfermedad que produce es similar, pero más leve. Se adhiere a la mucosa del intestino delgado, no la invade, y elabora toxinas. Es la conocida como diarrea del viajero. Se adquiere por ingerir agua o alimentos contaminados y se necesita ingerir un elevado inóculo de bacterias. Su identificación es compleja (en coprocultivos). La diarrea producida por cepas de ETEC es causada por la acción de dos diferentes toxinas: toxina termolábil (LT) y toxina termoestable (ST). Hay dos LT y su estructura y mecanismo de acción es el de la toxina colérica.
2. E. coli enteroagregativo (EAggEC): diarrea persistente en niños. Las cepas de EAggEC no son invasivas y no se adhieren de forma uniforme sino que lo hacen en pequeños agregados. Producen una toxina similar a ST llamada EAST (ST enteroagregativa).
3. E. coli enteropatógeno (EPEC): diarrea severa en niños pequeños, de gran trascendencia en países subdesarrollados. Tiene un patrón de adherencia en parches y produce alteraciones importantes en la ultraestructura de las células del huésped. Elabora toxinas de acción citotoxigénica.
4. E. coli enterohemorrágico (EHEC): colitis hemolítica, síndrome urémico hemolítico (SUH) O157:H7 es el serotipo característico de este grupo. La mala cocción de la carne. Produce toxinas llamadas también verotoxinas por su acción citotóxica sobre cultivos de células Vero de laboratorio.
5. E. coli enteroinvasor (EIEC): enfermedad indistinguible de la disentería producida por Shigella. Toxina similar al sighella.

SHIGELLA: bacterias estrictamente humanas

S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii y S. sonnei. Enfermedad inflamatoria sanguinolenta. Produce una toxina, denominada toxina de Shiga, que está asociada al espacio periplásmico y se libera durante la lisis bacteriana. La toxina no es esencial, pero juega un rol fundamental en la patogenia del SUH. Se trasmite directamente por las manos o indirectamente por alimentos o agua contaminados con heces humanas. Inóculo (dosis infectante pequeña para causar enfermedad). Enfermedad autolimitada.

ANTIBIOGRAMA: estudio de la sensibilidad del microorganismo

productor de una enfermedad, a los antimicrobianos. Se debe hacer un antibiograma antes de establecer el tratamiento de una enfermedad de naturaleza microbiana. Las pruebas de sensibilidad, el antibiograma, es una técnica estandarizada, es decir, los resultados en cuanto a sensibilidad y resistencia se comportan paralelamente in vivo e in vitro. Es importante saber cuándo realizar estas pruebas:

1. Cuando no se pueda predecir la sensibilidad de un microorganismo: los más estudiados son los gram- fermentadores y no fermentadores, Staphylococcus aureus, algunos anaerobios y patógenos oportunistas inusuales.
2. Como labor de vigilancia del laboratorio que informa sobre la evolución de las resistencias. Existe una norma en Microbiología que es: no efectuar directamente un antibiograma del producto patológico, ni tampoco utilizar mezclas de gérmenes. Por tanto, se efectúa siempre un aislamiento por agotamiento en placa.

m.o sensible: cuando el agente antimicrobiano puede alcanzar niveles en plasma iguales al menos a la CMI en el lugar de la infección. C.M.I es la concentración mínima inhibitoria, representa la mínima cantidad de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo. M.o resistente: cuando la concentración máxima de antimicrobiano que se puede localizar en el lugar de la infección no es suficiente para eliminar el mo. Sensibilidad intermedia cuando no es afectado por dosis normales de antimicrobiano dadas a intervalos normales, pero si se acumula en el lugar de la infección sin llegar a dosis que produzcan efectos tóxicos.

PASOS: Partimos de un cultivo puro (solo un tipo de mo), preparamos el inóculo, lo estandarizamos al 0,5 de MacFarland, Siembra en Mueller-Hinton con kirbybauer (3 giros), añadimos discos de Ab, incubamos 37º 24h y medimos en mm los halos de inhibición.

ANTIBIÓTICOS QUE ACTÚAN SOBRE LA PARED CELULAR: (Beta-lactámicos)

1. Penicilinas: Penicilina G sódica y la forma oral Penicilina V, Aminopenicilinas, Isooxazolilpenicilinas, Carboxipenicilinas, Ureidopenicilas. 2. Cefalosporinas: proceden de productos de fermentación de hongos del género Cephalosporium y cuyo anillo base es el ácido 7-aminocefalospóranico. 3. Carbapenemas: el principal representante es el imipenem. 4. Monobactamas: activo frente a G-, especialmente enterobacterias y Pseudomonas. 5. Inhibidores de β-lactamasas (no son antibióticos como tal): tienen actividad antimicrobiana muy reducida. Se les llama inhibidores suicidas.

INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

1. Aminoglicósidos: estreptomicina. 2. Tetraciclinas: 30s del ribosoma. Doxiciclina. 3. Cloranfenicol: 50s del ribosoma. 3. Macrólidos: Actúan uniéndose a la subunidad 50s del ribosoma. Eritromicina. 4. Lincosaminas: clindamicina.

GRUPO DE INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

1. Quinolonas: inhibidores de la replicación del ADN. Ácido nalidíxico. 2. Nitroimidazoles: actúan por un mecanismo citotóxico rompiendo el ADN. Metronidazol y Tinidazol. 3. Nitrofurantoína: compuesto sintético que causa daño en el ADN.

GRUPO DE LOS INHIBIDORES DE LA FUNCIÓN DE LA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA

1. Polimixinas: actúan sobre la membrana celular y también sobre la pared. Bacitracina.

GRUPO DE LOS QUE INHIBEN EL METABOLISMO BACTERIANO (SÍNTESIS DE ÁCIDO FÓLICO

1. Sulfamidas. 2. Trimetoprim.

OTROS GRUPOS

1. Rifampicinas: rifampicina. 2. Fosfomicina.

PSEUDOMONAS: P. aeruginosa MC, Levine y AS: β-hemolíticas

Se puede potenciar la producción de pigmentos con medios de cultivo específicos: pioverdina (verde), piorrubina (rojo), piomelanina (negro), piocianina (azul)-aeruginosa. No fermentan glucosa, utilizan diversos azúcares oxidativamente con producción de ácido. La Vía Entner Doudoroff es una vía alternativa a la fermentación, para la oxidación de la glucosa a ácido pirúvico. De cada molécula de glucosa se producen 2 moléculas de NADPH y 1 molécula de ATP. Las bacterias que tienen las enzimas de esta vía pueden metabolizar la glucosa sin la glicólisis. Esta vía generalmente no se encuentra en las bacterias gram positivas, se encuentra en algunas bacterias gram negativas, es típica de las bacterias del género Pseudomonas. (TABLA TUBOS: tubo abierto amarillo, tubo cerrado verde: oxidación).

ESTRUCTURA ANTIGÉNICA N-MENINGITIDIS

Polisacárido capsula, Endotoxina, Proteasa de Ig A, Sustancias quelantes del hierro, Pili. La presencia de cápsula está asociada a la virulencia. Al menos trece serogrupos (A, B, C W135, Y). Se dispone de vacunas para los serogrupos A y C. Existen vacunas tetravalentes anti A, C, Y y W135. En general son poco eficaces en menores de dos años. Es obligatorio notificar esta enfermedad a las autoridades sanitarias.

ESTRUCTURA ANTIGÉNICA N. GONORRHOEAE.

Pili, proteína I, II y III, adhesinas, proteínas reguladoras, proteasa de IgA, lipopolisacárido y plásmidos.

MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE N. GONORRHOEAE

Uretritis y cervicitis, orquiepididimitis, enfermedad inflamatoria pélvica, proctitis, faringitis, conjuntivitis y enfermedad gonocócica diseminada.

HAEMOPHILUS INFLUENZAE

Especie tipo y puede causar enfermedades graves, invasivas. Oportunista. H. influenzae serotipo b era una de las causas más importantes de meningitis y neumonía bacteriana en niños. Estos gérmenes requieren para su desarrollo de uno o dos factores, llamados V (NAD) y X (hemina o protoporfirina), presentes en la sangre. El factor X es la protoporfirina IX para gérmenes que poseen una enzima quelante del hierro (como H. influenzae), o la hemina para gérmenes que no la poseen (como H. aegyptius). Los microorganismos que requieren de factor V no crecen en agar sangre convencional. El factor V puede ser agregado al medio o proporcionado por otro microorganismo que crezca en su proximidad (por ej. una colonia de Staphylococcus). Este crecimiento alrededor de una colonia que le proporciona factores de crecimiento se denomina “satelitismo” y no es exclusivo de Haemophilus, sino también de ciertos Streptococcus.

BRUCELLA

Producen enfermedad fundamentalmente en animales y ocasionalmente en humanos. Son parásitos intracelulares facultativos, con poca actividad metabólica. Hay 6 especies: melitensis, abortus, suis, neotomae, ovis y canis. Técnicas especiales siembra: hemocultivo. Técnica de Ruiz-Castañeda: usa un medio bifásico en un mismo frasco. El medio líquido es para el enriquecimiento de las brucellas de la sangre y el sólido es para la resiembra. Estos frascos pueden llevar CO₂ incorporado. El volumen de sangre que se inocula no debe ser superior al 20% del volumen del medio. El frasco se incuba en posición vertical para favorecer el enriquecimiento de brucellas durante 48 horas y a continuación se incuba en posición horizontal para que en el medio solido se depositen las brucellas. El hemocultivo se observa cada 4-5 días hasta un total de 30 días. Técnica Isolator: se trata de un sistema de lisis-centrifugación, realizado en el mismo tubo. La muestra de sangre inoculada (10 mL en adultos) se lisa mediante la acción de detergentes y se concentra por centrifugación. El sedimento que se obtiene se siembra en un medio de cultivo sólido.

BORDETELLA PERTUSSIS

: predilección por el epitelio respiratorio ciliado, produce múltiples adhesinas que le permiten adherirse de forma específica al epitelio respiratorio. De éstas las más estudiadas son: la fitohemaglutinina (hemaglutinina filamentosa o Fha) y la toxina de Pertussis.

La toxina de Pertussis (Ptx): también llamada factor promotor de linfocitosis, esta toxina puede actuar como toxina y como adhesina. Exotoxina: mayor factor de virulencia. Ptx es responsable del aumento de las secreciones respiratorias y la producción exagerada de mucus que se observa en la tos convulsa.  La tos convulsa o TOS FERINA es una enfermedad severa de la infancia. Es sumamente contagiosa entre niños susceptibles. Después de la inhalación de gotitas infectadas, los gérmenes colonizan el tracto respiratorio. El período de incubación dura entre 5 y 21 días.

CAMPYLOBACTER: En base a los dos cuadros clínicos que produce (diarreas y septicemias), se procesan dos tipos de muestras: 1. HECES: se recomienda el cultivo directo de las heces en medio selectivo, si se tiene que posponer la siembra se utilizan medios de transporte como el Cary-Blair o Thayer-Martin. Campylobacteres viable de 1 a 3 semanas a temperaturas de refrigeración. Medios selectivos Campylobacter: 1. Skirrow: agar con sangre de caballo y tres antibióticos (vancomicina, polimixina B, trimetoprim). 2. Buzzler: agar tioglicolato, sangre, orina y suplementado con 5 antibióticos (bacitracina, novobiocina, colistina, ciclohexina y cefazolina). 3. Agar Campy-Bap: con sangre ovina y los mismo antibióticos del medio Skirrow más cefalotina y anfotericina. 2. SANGRE: Las especies C. fetus subespecie fetus y en ocasiones C. jejuni, C. laridis se han aislado en muestra de sangre como agentes etiológicos de septicemias en pacientes con sida o inmunodeprimidos. La presencia de C. jejuni y C. laridis suele ser intestinal. Es conveniente hacer una siembra primaria de la sangre en un frasco con medio líquido y posteriormente trasladarlo a un medio de cultivo sólido e incubarlo en atmósfera microaerofílica, pero a 37ºC.

HELICOBACTER PYLORI: Un método no invasivo (no se utilizan biopsias) es la Prueba de la urea marcada con carbono radiactivo. Consiste en administrar al paciente por vía oral urea marcada con Carbono 13 (C¹³). De estar presente H. pylori en el tubo digestivo, la urea es hidrolizada a nivel gástrico por la ureasa liberando CO₂ marcado. Este es detectado por técnicas espirométricas.

CHLAMYDIAS: El ciclo de desarrollo es quizá su característica más distintiva, se replica en el interior de la célula huésped, en su citoplasma, se dice que son parásitos intracelulares energéticos, puesto que no son capaces de generar por si mismos ATP. Se denomina cuerpo elemental a la forma infecciosa, ese cuerpo elemental es fagocitado por la célula huésped y en su interior se forma el fagolisosoma, que es una especie de vacuola. En su interior se reorganiza una nueva forma de mayor tamaño, pero menos infectiva que el cuerpo elemental, denominado cuerpo reticulado. Este cuerpo reticulado comienza a dividirse dando lugar a numerosos cuerpos elementales. El ciclo termina a las 48h con la lisis de la célula huésped y liberación de los cuerpos elementales listos para invadir células huésped vecinas.

Chlamydia trachomatis tracoma, una infección ocular, conjuntivitis. También linfogranuloma venéreo (LGV) y de la uretritis no gonocócica (UNG), ambas ETS. Raspado conjuntival, uretral o endocervical. Chlamydia psitacci causa la psitacosis. Esputo.