Identificació de bacteris

Identificació de bacteris

Mètodes d'identificació

• Macroscòpic: Observació de colònies a ull nu.
• Microscòpic: Tinció i observació al microscopi.
• Proves bioquímiques: Anàlisi de les reaccions metabòliques.
• Proves immunològiques: Detecció d'antígens i anticossos.

Morfologia macroscòpica (en placa, sembra per estria)

• Tamany de les colònies:
  • Puntiformes: <0.5 mm de diàmetre
  • Petites: 0.5-2 mm de diàmetre
  • Normals: 2-4 mm de diàmetre
  • Grans: >4 mm de diàmetre
  • Extenses: Ocupen tota la placa
• Forma: Depèn del microorganisme i del medi de cultiu.
• Superfície: Observació de perfil.
• Consistència: A ull nu o amb nansa de sembra.
• Transparència i color: Influenciat pel medi de cultiu.
• Cromogeni: Medi que indica el color del microorganisme.
• Presència d'halos de transparència: Ex: estudis d'hemòlisi.

Morfologia microscòpica

• Forma: Coc, bacil, espiril, vibrió.
• Agrupacions:
  • Diplo-: En parella
  • Estrepto-: En cadena
  • Estafilo-: En raïm
  • Sarcina: 8 cocs en forma de cub
  • Lletres xineses: Gèneres específics
• Característiques tintorials:

Examen de bacteris vius

• Examen en fresc: Sense tinció, per observar moviment (brownià).
• Mètode entre porta i cobre: Dipositar mostra, col·locar cobre a 45 graus.
• Mètode sobre gota penjant en porta excavat: Dipositar gota en cobre, col·locar porta excavada, girar.
• Coloració vital: Colorants diluïts (blau de metilè, roig de metil) per disminuir toxicitat.

Tincions bacterianes

• Milloren el contrast i permeten observar característiques específiques.
• Factors a tenir en compte:
  • Afinitat tinció-estructura
  • Puresa del colorant (evitar contaminació)
  • Conservació (protegir de la llum)
  • Tècnica/mètode de tinció (protocol)
  • Ús de mordents (fixació)
• Tipus de colorants (segons càrrega):
  • Àcids (aniónics): Tenyeixen estructures bàsiques (citoplasma). Ex: eosina, auramina.
  • Bàsics (catiònics): Tenyeixen estructures àcides (nucli, paret). Ex: blau de metilè, fucsina, cristall violeta, violeta genciana.
  • Neutres: Barreja de colorants àcid-base. Ex: eosina i blau de metilè.
  • Indiferents: Tenyeixen estructures específiques (lípids). Ex: Sudan.

Protocol general de tinció

1. Fixació de la mostra al portaobjectes.
2. Primera coloració (inundació o immersió).
3. Rentar amb aigua destil·lada.
4. Mordent (si cal).
5. Rentar amb aigua.
6. Decolorant (si cal).
7. Rentar amb aigua.
8. Segon colorant (de contrast).
9. Rentar amb aigua.
10. Assecar i observar.

Tinció simple

• Un sol colorant.
• Requereix fixació prèvia.
• Permet observar morfologia i disposició cel·lular.
• Protocol: Fixar, aplicar blau de metilè o roig de metil (3 min), rentar, assecar i observar.

Tincions diferencials

• Permeten diferenciar microorganismes.
• Utilitzen dos colorants i decolorants.
• Permeten observar forma, disposició i altres característiques.
• Dos tipus principals:

Tinció de Gram

• Dos colorants: cristall violeta (o violeta genciana) i safranina.
• Mordent: Lugol.
• Solució decolorant: Alcohol-acetona.
• Protocol: Fixar, aplicar cristall violeta (1 min) o violeta genciana (2 min), rentar, aplicar Lugol (1 min), decolorar, aplicar safranina (1 min), rentar i observar.
• Permet diferenciar bacteris Gram positius (violeta) de Gram negatius (rosa).

Tinció de Ziehl-Neelsen (BAAR)

• Per detectar Mycobacterium (tuberculosi) i Corynebacterium (BAAR+).
• Colorants: Fucsina fenicada, blau de metilè.
• Decolorant: Alcohol-àcid.
• No utilitza mordent.
• Protocol: Fixar, aplicar fucsina fenicada (3-5 min amb calor), rentar, decolorar, rentar, aplicar blau de metilè (2-3 min), rentar, assecar i observar.
• Resultats: Rosa (BAAR+), Blau (BAAR-).

Tincions estructurals

Tinció de càpsules (negativa)

• Tenyeix el fons, no la càpsula.
• Colorants: Tinta xinesa, nigrosina.
• Protocol: Fixar, aplicar colorant, observar.
• Resultats: Zones blanques (càpsules).

Tinció d'espores (Wirtz)

• Colorants: Verd malaquita, fucsina fenicada.
• Protocol: Fixar, aplicar verd malaquita (5 min amb calor), rentar, aplicar fucsina fenicada (3 min sense calor), rentar, observar.

Tinció de corpuscles metacromàtics

• Per observar grànuls de reserva.

Tinció d'auramina

• Per detectar Mycobacterium.
• Colorant fluorescent: Auramina.
• Requereix microscopi de fluorescència i treballar a les fosques.

Tinció taronja d'acridina

• Tenyeix DNA.
• Requereix microscopi de fluorescència i treballar a les fosques.

Tinció de cilis i flagels

• Difícil de tenyir.
• Recomanat utilitzar cultius joves (24h).

Proves bioquímiques

Estudi del metabolisme (enzims)

• Substrat: Substància incorporada al medi de cultiu.
• Procediment: Sembra + incubació = producte. O bé: Incubació + substrat (revelat) = producte.
• Cultiu pur: Aïllar un sol microorganisme.

Proves del metabolisme d'hidrats de carboni

• Determinen si el microorganisme utilitza hidrats de carboni com a font d'energia.
• Tipus de metabolisme: Fermentació (gas), oxidació (sense gas).

Prova d'oxidació-fermentació de Hugh-Leifson

• Medi inicial: Verd. Utilització d'hidrat: Groc.
• Procediment: Un tub destapat (oxidació), un tub amb parafina (fermentació).
• Finalitat: Diferenciar enterobacteris (fermenten glucosa) de pseudomones (oxiden glucosa).

Producció d'àcid-gas

• Medi de cultiu líquid.
• Canvi de color: Vermell (inicial) a groc (àcid).
• Alliberament de gas: Campana de Durham.

Beta-D-Galactosidasa

• Determina si el microorganisme utilitza lactosa.
• Medi: ONPG (groc si s'utilitza galactosidasa).
• Resultats: Groc a les 24h (fermentació ràpida), groc després de 24h (fermentació lenta), no groc (no fermentació).

Proves del metabolisme proteic

• Proteïnes → pèptids → aminoàcids.

Hidròlisi de gelatina

• Determina si el microorganisme degrada gelatina.
• Gelatina: Sòlida a temperatura ambient, líquida a >28 graus.
• Procediment: Incubació a temperatura ambient o a 37 graus (refredament ràpid en gel).
• Presentació: Tub, placa.

Prova de Kohn

• Medi de cultiu líquid amb disc de carbó recobert de gelatina.
• Degradació de gelatina: Carbó s'estén i es torna negre.

Producció d'H₂S

• Determina si el microorganisme produeix H₂S a partir de proteïnes.
• Precipitat negre: Producció d'H₂S (reacció amb sals de metalls).
• Metalls: Inhibidors del creixement.
• Tires reactives amb metalls pesants: Detecten H₂S.
• Medi àcid: Necessari per a la producció d'H₂S.

Descarboxilació d'aminoàcids

• Aminoàcids estudiats: Ornitina (ODC), arginina (ADC), lisina (LDC).
• Medi líquid: Caldo Moeller (amb hidrats de carboni).
• Tub control: Sense aminoàcids.
• Canvi de color: Vermell (inicial) a groc (utilització d'hidrats de carboni), de groc a vermell (utilització de proteïnes).

Proves enzimàtiques

Oxidasa

• Enzim present en microorganismes aeròbics i anaeròbics facultatius.
• Reactiu: Oxidasa de Kovacs.
• Resultats: Violeta/fosc (positiu), no color/color tardà (negatiu).
• No utilitzar medis amb glucosa (inhibeix l'enzim).
• Finalitat: Diferenciar enterobacteris (oxidasa -) de pseudomones (oxidasa +).

Catalasa (peroxidasa)

• Degrada aigua oxigenada (H₂O₂).
• Reactiu: H₂O₂.
• Resultats: Bombolles (positiu), no bombolles (negatiu).
• No utilitzar medis amb hemoglobina.
• Finalitat: Diferenciar estreptococs (catalasa -) d'estafilococs (catalasa +).

Coagulasa

• Estimula la formació de coàguls.
• Plasma de conill.
• Incubació: 4 hores al bany maria o 24 hores a l'estufa.
• S. aureus: Coagulasa + (4 hores).
• Fibrinolisina: Destrueix coàguls (S. aureus a les 24h).

Ureasa

• Medi: Ureasa Christensen.
• Degrada urea.
• Finalitat: Identificar Proteus (6h).
• Resultats: Vermell (positiu), groc (negatiu).

Reducció de nitrats

• Determina si els nitrats es redueixen a nitrits, nitrogen o altres elements.
• Medi de cultiu líquid amb campana de Durham.
• Incubació: 24h.
• Reactius: Nitrit 1 i nitrit 2.
• Resultats: Vermell (reducció a nitrits), gas (reducció a nitrogen).
• Sulfat de zinc: Redueix nitrats no reduïts (vermell si negatiu).
• Estudia enterobacteris.

Proves bioquímiques simultànies

Macrotècniques

Agar ferro-Kligler (KIA)

• Medi sòlid.
• Estudia: Fermentació de lactosa i glucosa, producció de gas i H₂S.
• Medi: Lactosa i glucosa (més lactosa).
• Sembra: Picadura i estria.
• Incubació: 24h.
• Resultats:
  • Glucosa +, lactosa -: Picadura groga, superfície vermella.
  • Glucosa +, lactosa +: Tot groc.
  • No utilització: No canvia.
  • H₂S: Precipitat negre.
  • Gas: Bombolles.
• Nomenclatura: A (àcid, groc), Alc/K (alcalí, vermell), H₂S, ○ (gas).
• Finalitat: Identificar enterobacteris (Salmonella, Shigella).

Agar ferro-triple sucre (TSI)

• KIA + sacarosa.
• S'utilitza si KIA és negatiu per a lactosa.
• Interpretació similar a KIA (sacarosa en lloc de lactosa).
• Salmonella: Precipitat negre (H₂S).

ASiM

• Estudia: Producció d'H₂S (negre), producció d'indol (vermell si positiu), motilitat.
• Medi semisòlid.

IMViC

• Proves: Indol (I), roig de metil (M), Voges-Proskauer (V), citrat (C).
• Interpretació conjunta.
• Roig de metil: Fermentació àcid-mixta. Reactiu: Roig de metil. Vermell (positiu), groc (negatiu).
• Voges-Proskauer: Fermentació butilenglicòlica. Reactius: VP1, VP2. Vermell (positiu).
• Citrat: Utilització de citrat. Verd/blau (inicial). Blau (positiu), verd (negatiu).

Microtècniques

API

• Tira plàstica amb pous amb medis de cultiu deshidratats.
• Inoculació de tots els pous.
• Incubació: 37 graus, 24h.
• Reactius específics.

Enterotube

• Dispositiu amb medis de cultiu.
• Inoculació amb una nansa.
• Inconvenients: Contaminació, només per enterobacteris.

Vitek

• Sistema informatizat.
• Resultats en 4 hores.
• Cost elevat.

Proves immunològiques

Basades en reaccions Ag-Ac.

• In vivo: En pacients o animals d'experimentació. Ex: Tuberculina.
• In vitro: En mostres.

Precipitació

• Detecta Ag o Ac.
• Serologia: Busca Ac.
• Formació d'immunocomplexes insolubles (precipitat).

Aglutinació

• Unió Ag-Ac (macroscòpica).
• Tipus:
  • Directa: Ag unit naturalment a una cèl·lula. Ex: Ag eritrocitaris.
  • Indirecta: Ag unit artificialment a una partícula.
  • Inhibició de l'aglutinació: Incubació de cèl·lules amb Ag + Ac, després amb partícules amb Ag. Aglutinació: pacient sense Ag. No aglutinació: presència d'Ag.
• Microaglutinació: Petita quantitat de mostra i reactiu.
• Hemaglutinació: Ag unit a eritròcits.
• VDRL: Per a malalties de transmissió sexual.

Immunofluorescència

• Ag o Ac marcat amb molècula fluorescent.
• Requereix microscopi de fluorescència i treballar a les fosques.
• Directa: Mostra fixada + Ac marcat. Fluorescència: positiu.
• Indirecta: Ac del pacient + Ag fixat + Ac marcat (antiglobulina). Fluorescència: positiu.

Enzimimmunoassaig (ELISA)

• Marcador: Enzim.
• Reactiu: Substrat de l'enzim (color).
• Color: positiu. No color: negatiu.
• Interpretació automatitzada.

Radioimmunoanàlisi (RIA)

• Marcador: Radioactivitat.
• Busca Ag en la mostra.
• Ag marcat + Ac + mostra del pacient (Ag sense marcar).
• Separació d'immunocomplexes i mesura de radioactivitat.
• Molta radioactivitat: pocs Ag.

Reacció de fixació del complement

• Reactiu: Complement.
• Eritròcits sensibilitzats.
• Busca Ac en la mostra.
• No hemòlisi: positiu. Hemòlisi: negatiu.
• Prova quantitativa.