Identificació d'Aminoàcids, Glúcids i Proteïnes

Identificació d'Aminoàcids per Cromatografia

L'ús de la cromatografia és de gran importància per identificar aminoàcids. La fase mòbil emprada generalment és una mescla de butanol/àcid acètic/aigua. La separació implica que els aminoàcids amb cadena lateral (R) de caràcter més apolar tindran tendència a desplaçar-se amb la fase mòbil, mentre que els aminoàcids polars (amb càrrega o sense) seran retinguts per la fase estacionària. Això és perquè la fase mòbil està formada per solvents més apolars que l'aigua, que és el solvent de la fase estacionària.

Punt Isoelèctric (pI) dels Aminoàcids

El punt isoelèctric (pI) és el pH en el qual una molècula té càrrega elèctrica neta neutra. Per damunt d'aquest pH, els aminoàcids presenten càrrega negativa; per davall, presenten càrrega positiva. Cada aminoàcid té un pI determinat, la qual cosa permet diferenciar-los entre si en una barreja quan se sotmet a un camp elèctric (electroforesi).

Desnaturalització de Proteïnes

La desnaturalització implica la pèrdua de l'estructura tridimensional nativa d'una proteïna. Es pot induir per diversos mètodes:

• Desnaturalització tèrmica: Agafar una mostra de 3 ml en un tub d'assaig i escalfar al bany maria.
• Desnaturalització per pH extrem: Agafar una mostra de 3 ml en un tub d'assaig i afegir 0,5 ml d'àcid clorhídric (o una base forta).
• Desnaturalització per solvents orgànics: L'addició de solvents com l'etanol o l'acetona pot causar desnaturalització. (Nota: El procediment original "escalfar, refredar, afegir NaOH i agitar" no correspon directament a aquest mètode estàndard).
• Reaccions químiques (Nota: Les següents reaccions no són mètodes de desnaturalització per se, sinó proves d'identificació):
  • Reacció de Hopkins-Cole: Detecta la presència de triptòfan. Agafar mostra en tub d'assaig, afegir reactiu específic.
  • Reacció amb Ninhidrina: Detecta la presència d'aminoàcids lliures (especialment grups amino primaris). Agafar mostres en tubs d'assaig (ex: una amb serina, una altra amb prolina), afegir ninhidrina i escalfar al bany maria.
  • Reacció de Biuret: Detecta enllaços peptídics (proteïnes). Agafar mostra en tub d'assaig, afegir reactiu de Biuret.

Una desnaturalització es pot identificar visualment a través d'una disminució de la solubilitat, podent arribar al punt de precipitació.

Glúcids: Tipus i Funcions

Monosacàrids

Són els glúcids més simples, constituïts per una sola cadena polihidroxialdehídica o polihidroxicetònica. En funció del nombre de carbonis, s'anomenen trioses, tetroses, pentoses, hexoses i heptoses.

Característiques i Funcions:

• Serveixen de combustible cel·lular (ex: glucosa). La glucòlisi, que oxida la glucosa a àcid pirúvic, és una ruta metabòlica fonamental.
• Tenen poder reductor: són capaços d'oxidar-se (perdre electrons) davant d'altres substàncies que es redueixen.
• Tenen almenys un carboni asimètric (excepte la dihidroxiacetona).
• Són sòlids cristal·lins, de color blanc, gust dolç i hidrosolubles.
• No són hidrolitzables en unitats més petites.

Oligosacàrids

Formats per la unió de dos a deu monosacàrids mitjançant un enllaç covalent anomenat O-glicosídic. Els més importants són els disacàrids (unió de dos monosacàrids).

Funció principal: Energètica (ex: sacarosa, lactosa).

Polisacàrids

Formats per la unió de més de deu monosacàrids per mitjà de l'enllaç O-glicosídic, amb la pèrdua consegüent d'una molècula d'aigua per cada enllaç.

Característiques i Funcions:

• Tenen pesos moleculars molt elevats.
• No tenen gust dolç.
• Poden ser insolubles (ex: cel·lulosa) o formar dispersions col·loidals (ex: midó).
• Poden exercir funcions estructurals (ex: cel·lulosa, quitina) o de reserva energètica (ex: midó, glicogen).

Anàlisi d'Oligosacàrids i Glicoconjugats

Determinació de la Posició dels Enllaços Glicosídics (Glicoproteïnes/Glicolípids)

Per saber la posició dels enllaços glicosídics en una glicoproteïna o un glicolípid:

1. Obtenir oligosacàrids mitjançant endoglicosidases.
2. Separar aquests oligosacàrids mitjançant tècniques com la cromatografia d'intercanvi iònic.
3. Realitzar una metilació exhaustiva amb el reactiu CH₃I i una base forta per metilar tots els grups -OH lliures.
4. Fer una hidròlisi àcida per trencar els enllaços glicosídics, produint monosacàrids parcialment metilats. Els grups -OH que estaven involucrats en els enllaços glicosídics o en l'enllaç al carboni anomèric no estaran metilats.
5. Analitzar els monosacàrids metilats (sovint per cromatografia de gasos acoblada a espectrometria de masses) per determinar quines posicions estaven implicades en els enllaços.

Determinació de la Seqüència, Posició i Configuració d'Enllaços en Oligosacàrids

Per analitzar una barreja d'oligosacàrids:

1. Separar els diferents oligosacàrids mitjançant cromatografia de filtració en gel, cromatografia d'intercanvi iònic o cromatografia d'afinitat.
2. Per a cada oligosacàrid aïllat, determinar la seqüència, posició i configuració (α o β) dels enllaços mitjançant tècniques com:
   • RMN (Ressonància Magnètica Nuclear) i/o Espectrometria de Masses (MS/MS).
   • Hidròlisi enzimàtica seqüencial amb glicosidases específiques (exo- i endoglicosidases) per obtenir fragments més petits. Aquests fragments es poden analitzar posteriorment (per exemple, per metilació o MS).

Determinació de la Composició Monosacarídica d'Oligosacàrids

Per saber quins tipus i quantitat de monosacàrids componen una mostra d'oligosacàrids:

1. Opcionalment, separar els oligosacàrids si la mostra és una barreja (com s'ha explicat abans).
2. Dur a terme una hidròlisi completa amb un àcid fort (ex: TFA, HCl) per trencar tots els enllaços glicosídics i alliberar els monosacàrids constituents.
3. Analitzar i quantificar els monosacàrids obtinguts mitjançant cromatografia de gas-líquid (GC) (sovint després de derivatització) o cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC).

Seqüenciació de Proteïnes per Espectrometria de Masses

Es pot utilitzar un espectròmetre de masses per determinar la seqüència d'una proteïna?

Sí. La tècnica d'espectrometria de masses (MS) permet determinar la massa de les molècules (o fragments) a partir de la seva relació massa/càrrega (m/z). Encara que normalment s'aplica a pèptids (fragments de proteïnes), permet reconstruir la seqüència de la proteïna original.

Un espectròmetre de masses consta de tres parts principals:

• Font d'ions: Ionitza les molècules de la mostra.
• Analitzador de masses: Separa els ions segons la seva relació m/z.
• Detector: Detecta els ions separats i registra el senyal.

Mitjançant aquestes parts, es pot obtenir informació seqüencial de pèptids (i per tant, proteïnes) utilitzant tècniques d'ionització suau acoblades a anàlisis de fragmentació (MS/MS), com ara:

1. MALDI-TOF (Ionització per Dessorció Làser Assistida per Matriu amb anàlisi de massa per Temps de Vol): Molt útil per determinar la massa de pèptids intactes (obtinguts per digestió prèvia de la proteïna) i, en configuracions TOF/TOF, per a la fragmentació i seqüenciació.
2. ESI (Ionització per Electrospray): Sovint acoblada a analitzadors com trampes iòniques o quadrupoles, permet la ionització de pèptids directament des d'una solució (per exemple, l'eluat d'una HPLC) i la seva posterior fragmentació (MS/MS) per obtenir informació de la seqüència.