Guia de Tècniques de Sembra i Inoculació en Microbiologia

Material de sembra i inoculació

Nanses de sembra

Filament amb una anella de plàstic o platí. S'utilitzen per sembrar mostres líquides o sòlides en superfícies.

Fil de platí

S'utilitza per fer sembres en picada (sembrar dins del medi de cultiu).

Nanses de Digralsky

Varetes de vidre que tenen l'extrem pla. Serveixen per sembrar mostres líquides. S'han d'esterilitzar amb alcohol i flama.

Hisops

Varetes de plàstic o fusta que porten cotó fluix al seu extrem. S'usen per recollir mostres directament del pacient. Hi ha hisops que contenen un medi de cultiu perquè la cèl·lula no mori; s'utilitzen com a medi de transport.

Pipetes

S'utilitzen per sembrar una mostra líquida en un medi líquid.

Preparació dels inòculs

Els inòculs es preparen quan no tenim prou quantitat de microorganismes per estudiar. Un inòcul és una quantitat representativa de la mostra. Per preparar-lo, agafem els microorganismes i els col·loquem en un tub amb medi líquid, que s'incuba a l'estufa a 37 °C durant 4 hores.

La quantitat de cèl·lules es mesura segons la terbolesa, comparant-la amb l'escala estandarditzada de McFarland. Aquesta escala consisteix en una bateria de 10 tubs amb 10 dilucions diferents, on cada tub té associat un nombre diferent i determinat de microorganismes. Aquests tubs no contenen microorganismes, sinó productes químics que simulen la terbolesa corresponent.

Mètodes d'inoculació i sembra

Per a la sembra d'un inòcul en medi líquid, agafem una petita quantitat de mostra, la col·loquem dins del tub i l'agitem.

Sembra d'inòcul en medi sòlid (placa de Petri)

Tècnica de Barry

Es prepara el medi de cultiu escalfant-lo per tenir-lo en estat líquid i es deixa refredar fins a 45-50 °C. S'hi afegeix l'inòcul i s'agita perquè es reparteixi. Finalment, s'aboca part del medi amb l'inòcul en una placa de Petri i es deixa refredar. És important mesurar bé la temperatura amb un termòmetre i garantir una bona agitació.

Sembra amb nansa de Digralsky

Per a mostres líquides, es col·loca la mostra a la placa amb una pipeta i, amb una nansa de Digralsky, es reparteix per tota la superfície del medi girant la placa.

Sembres per esgotament o estria

S'agafa la mostra amb una nansa de sembra i es fan moviments en ziga-zaga d'un costat a l'altre de la placa. Les estries han de ser tan estretes com sigui possible, però sense tocar-se, i extenses, però sense tocar les parets de la placa.

La finalitat és obtenir colònies aïllades. A mesura que s'estria, es va dipositant menys mostra. En arribar a l'últim terç de la placa, la quantitat de microorganismes és molt baixa, la qual cosa permet obtenir colònies aïllades.

Sembra per esgotament o estria múltiple

Es sembra un terç de la placa, es retira la nansa i s'esterilitza. A continuació, es col·loca la nansa en un extrem de la sembra anterior i es repeteix el procés en un altre terç de la placa. Aquest pas es fa un mínim de tres vegades. L'última estria ha de ser més petita i en direcció al centre. La seva finalitat és obtenir colònies aïllades a la part final.

Tècnica dels quatre quadrants

Es divideix la placa en quatre quadrants imaginaris. S'agafa la mostra i es fa la sembra al primer quadrant. Després, es passa la nansa als altres quadrants sense tornar a carregar mostra ni esterilitzar.

Tècnica dels tres girs

Es sembra fins a la meitat de la placa. S'aixeca la nansa i s'esterilitza. Es gira la placa 90 graus i se sembra de nou, contactant amb la sembra anterior. Aquest procés es repeteix tres vegades, procurant que la tercera sembra no toqui la primera.

Sembra per dilució

Es prepara una bateria de dilucions i se sembra la placa. Aquesta tècnica serveix per fer recomptes cel·lulars i estudis de resistència o sensibilitat a un antibiòtic.

Sembra en tub de medi sòlid

Sembra per estria en tub inclinat

Cal flamejar l'entrada del tub. S'agafa la nansa de sembra, s'introdueix fins al fons intentant no tocar les parets i, sense arribar a tocar el fons, es comença a sembrar la superfície del medi en forma de ziga-zaga. La principal dificultat és la manipulació.

Sembra per picada

S'agafa la mostra amb un filament i es clava al centre del medi sòlid del tub, sense que arribi a tocar el fons.

Sembra combinada d'estria i picada

Es realitza en un tub amb medi inclinat. Primer, es fa la picada. Després, es retira el filament del medi, però no del tub, i es fa la sembra per estria a la superfície.

Cultiu i identificació de soques

Paràmetres a tenir en compte:

• Temperatura: 35-36 °C.
• Atmosfera: Variarà en funció de la mostra; serà aeròbia, anaeròbia o ambdues.
• Temps: 24, 48 hores, etc.

Les mostres s'han d'identificar en un punt que no molesti, mai a la tapa de la placa ni al tap del tub.

Recompte cel·lular bacterià

No sempre és necessari saber el nombre exacte de microorganismes presents. De vegades, el simple fet que un microorganisme estigui present o no ja és indicatiu. Sabem si un pacient està infectat si trobem algun organisme anormal que no hi hauria de ser.

Mètodes indirectes

No es compten les cèl·lules una a una, sinó que s'estudia algun paràmetre relacionat amb aquestes. Hi ha tres mètodes principals:

Determinació analítica de molècules

Consisteix en la determinació de diferents molècules que estan relacionades amb una quantitat concreta de cèl·lules.

Gravimetria

Es mesura el pes en sec, de manera que s'associa un pes determinat a cada cèl·lula.

Turbidimetria (la més utilitzada)

Es realitza amb un espectrofotòmetre, que fa passar llum a través de la mostra i detecta la quantitat de llum que l'ha travessada. Una mostra normal és transparent (hi passa tota la llum); en el moment que no hi passa tota la llum, vol dir que hi ha alguna cosa anormal. La lectura es farà comparant amb l'escala de McFarland, mesurant la quantitat de radiació que passa a través del tub.

Mètodes directes

Cada cèl·lula es considera com una sola unitat.

Directes totals

Comptatge amb una cambra de recompte o amb portaobjectes. Si es fa amb portaobjectes, es col·loca una gota de mostra i, sobre aquesta, el cobreobjectes, i es fa un recompte en ziga-zaga.

Lectures de cultius (el més utilitzat)

També coneguts com a recompte de viables en placa. Es recompten les cèl·lules vives, que són les que interessen. Aquesta tècnica es fa amb un banc de dilucions. Es posen les mostres a les estufes i es fa el recompte de colònies, considerant aquelles plaques que tinguin entre 20 i 300 colònies. Un cop acabat el recompte, es desfà la dilució multiplicant per la inversa o fent la mitjana aritmètica.

Semidirectes totals

Es realitzen amb citometria de flux. És un procés més senzill que en el cas de les cèl·lules sanguínies.