Guia Essencial de Tècniques de Cultiu Cel·lular

Aplicacions Principals del Cultiu Cel·lular

El cultiu cel·lular té aplicacions en tres grans camps:

• Investigació bàsica: estudi de processos biològics fonamentals.
• Producció biotecnològica: elaboració de vacunes, proteïnes recombinants i anticossos.
• Estudis biomèdics i toxicològics: avaluació de fàrmacs i toxicitat de compostos.

Condicions de Treball i Esterilitat

Mesures d'Esterilitat al Laboratori

Per garantir un entorn de treball estèril, és crucial:

• Treballar en una cabina de seguretat biològica (classe II o III).
• Desinfectar superfícies i material amb alcohol al 70%.
• Utilitzar exclusivament material esterilitzat (autoclavat o irradiat).
• Evitar corrents d’aire que puguin transportar contaminants.
• Mantenir una correcta higiene personal i dels equips.

Condicions Bàsiques del Medi de Cultiu

• Temperatura: 36–37 °C.
• pH: 7,2–7,4.
• Atmosfera gasosa: 5% de CO₂ i humitat relativa alta.
• Pressió osmòtica: isotònica (280–320 mOsm/kg).

Funció de l'Incubador de CO₂

L'incubador manté el pH fisiològic del medi de cultiu a través del sistema tampó bicarbonat–CO₂. La concentració de CO₂ se sol fixar en un 5% per regular l'equilibri carbonat-bicarbonat i, per tant, el pH.

El Medi de Cultiu

Components Essencials

• Aminoàcids: per a la síntesi de proteïnes.
• Glucosa: com a font principal d'energia.
• Sals inorgàniques: per mantenir l'equilibri osmòtic.
• Vitamines: actuen com a cofactors enzimàtics.
• Sistema tampó (buffer): per estabilitzar el pH.
• Sèrum: aporta factors de creixement (opcional).
• Antibiòtics: per al control puntual de contaminacions (no recomanat per a ús rutinari).
• Indicador de pH: comunament, el vermell de fenol.

Ús del Sèrum: Avantatges i Inconvenients

El sèrum és el component líquid de la sang que no coagula. El seu ús presenta:

• Avantatges: aporta una gran varietat de factors de creixement, hormones i nutrients essencials.
• Inconvenients: alta variabilitat entre lots, risc de contaminants (virus, prions, micoplasma) i pot interferir en certs experiments.

Precaucions en la Manipulació del Medi

Per evitar la degradació dels components sensibles, cal:

• Evitar l'exposició a la llum directa.
• No exposar el medi a temperatures altes.
• Evitar cicles repetits de congelació i descongelació.
• Afegir els components més sensibles (com la glutamina o factors de creixement) just abans d'utilitzar-lo.
• Conservar-lo a 4 °C i protegit de la llum.

Processos i Tècniques de Cultiu

Disgregació de Teixits

Per obtenir cèl·lules a partir d'un teixit, s'utilitzen dos mètodes:

• Disgregació enzimàtica: Utilitza enzims com la tripsina o la col·lagenasa per trencar les unions cel·lulars de manera suau.
• Disgregació mecànica: Utilitza forces físiques (pipeteig, filtració), però és un mètode més agressiu que pot danyar les cèl·lules.

Mètodes de Separació Cel·lular

Les tècniques més comunes inclouen la centrifugació simple, la centrifugació en gradient de densitat i l'elutriació (separació per mida i densitat).

Corba de Creixement Cel·lular

El creixement d'un cultiu segueix quatre fases característiques:

1. Fase de latència (lag): adaptació de les cèl·lules al nou entorn.
2. Fase exponencial (log): divisió cel·lular ràpida.
3. Fase estacionària: la taxa de creixement disminueix, sovint per inhibició per contacte (confluència).
4. Fase de mort: disminució del nombre de cèl·lules viables.

Manteniment del Cultiu: Feed i Subcultiu

• Feed (alimentació): consisteix a substituir el medi de cultiu vell per medi fresc per reposar nutrients.
• Subcultiu (o pas): quan les cèl·lules arriben a la confluència, se separen, es dilueixen i es redistribueixen en nous flascons amb medi fresc per permetre que continuïn creixent.

Ús de la Tripsina

La tripsina és un enzim que s'utilitza per trencar les proteïnes d'unió de la matriu extracel·lular, permetent desenganxar les cèl·lules adherents de la superfície de la placa de cultiu durant el subcultiu.

Crioprotectors i Congelació Cel·lular

Els crioprotectors (com el DMSO o el glicerol) eviten la formació de cristalls de gel intracel·lulars i redueixen el dany osmòtic durant la congelació, millorant la supervivència de les cèl·lules després de la descongelació.

Control de Qualitat i Bones Pràctiques

Efectes de la Pressió Osmòtica

• Medi hipotònic: l'aigua entra a les cèl·lules, que s'inflen i poden arribar a esclatar (lisi cel·lular).
• Medi hipertònic: l'aigua surt de les cèl·lules, que es deshidraten i es contrauen.

Per Què Evitar l'Ús Rutinari d'Antibiòtics?

L'ús continuat d'antibiòtics no és recomanable perquè:

• Poden emmascarar contaminacions de baix nivell.
• Fomenten la generació de resistències bacterianes.
• Poden ser tòxics per a alguns tipus de cèl·lules.
• Poden alterar el metabolisme cel·lular i interferir amb els resultats experimentals.

Tècniques de Verificació de Línies Cel·lulars

Per assegurar l'autenticitat i l'absència de contaminació, s'utilitzen tècniques com:

• PCR per a la detecció de micoplasma.
• STR profiling per a l'autenticació de la línia cel·lular.
• Microscòpia per a l'anàlisi morfològica.
• Cultius en medis selectius per detectar contaminacions bacterianes o fúngiques.

Tipus de Cultius Cel·lulars

Diferència entre Cultiu Primari i Línia Cel·lular

• Cultiu primari: s'obté directament d'un teixit. Aquestes cèl·lules tenen una vida útil limitada i un nombre finit de divisions (senescència).
• Línia cel·lular: es deriva d'un cultiu primari i ha estat estabilitzada (immortalitzada), cosa que li permet créixer de manera contínua i indefinida en les condicions adequades.