Gestión Integral de Muestras Biológicas y Proceso Analítico en Inmunoensayos

Recepción, Conservación y Almacenamiento de Muestras Biológicas

Fases Iniciales

• Toma de muestras: Obtención de una muestra representativa del espécimen a analizar. En RIA (Radioinmunoensayo), generalmente se realiza en sangre por venopunción u orina.
• Conservación de suero y plasma:
  • Hasta 24 horas: A 4ºC en un recipiente cerrado.
  • Más de 24 horas: En congelador.

Proceso Analítico General

Comprobación de resultados.

Métodos de Partición

El objetivo principal es contar una de las fases (ligada o libre) después de que ha tenido lugar la reacción entre el ligando (L), el ligando marcado (L*) y el anticuerpo (Ac): L + L* + Ac = L + L* + Ac + L-Ac + L*-Ac.

Características Ideales de un Método de Partición:

• Conseguir una perfecta separación de la fracción ligada (L-Ac, L*-Ac) de la libre.
• No estar influenciado por sustancias presentes en la reacción.
• Ser reproducible, sencillo, barato y rápido.
• No interferir en la reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac).

Tipos de Métodos de Partición

1. Adsorción del Antígeno Libre

1. Adsorción del antígeno libre en superficie porosa de sustancias como:
   • Carbón activo
   • Carbón revestido de dextrano
   • Silicatos (como el talco o el fluorosil)
   • Resinas de intercambio iónico
2. Centrifugar.
3. Decantación del sobrenadante.

2. Precipitación Inespecífica del Complejo Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac)

1. Adición de concentraciones elevadas de sales inorgánicas:
   • Sulfato de amonio ((NH4)2SO4)
   • Sulfato de sodio (Na2SO4)
   • PEG (Polietilenglicol)
   • Etanol
2. Las sales atrapan el H2O (agua).
3. Insolubilización del complejo Ag-Ac y precipitación.
4. Centrifugación.
5. Decantación del sobrenadante.

3. Precipitación Específica del Complejo Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac)

Método del Doble Anticuerpo (Ac2)

1. Adición de un segundo anticuerpo (Ac2) dirigido contra el anticuerpo del antisuero.
2. Se produce el complejo Ag*-Ac-Ac2 / Ag-Ac-Ac2, que son insolubles.
3. Precipitación del complejo.
4. Centrifugación.
5. Decantación del sobrenadante.

Método de la Proteína A

1. Adición de proteína A adosada a la pared de la bacteria Staphylococcus aureus.
2. Unión de la proteína A a la región Fc del anticuerpo (Ac).
3. Precipitación del complejo.
4. Centrifugación.
5. Decantación del sobrenadante.

4. Separación en Fase Sólida

1. El anticuerpo (Ac) está adsorbido o ligado químicamente a una matriz sólida insoluble:
   • Tubos revestidos de Ac.
   • Ac adsorbidos en esferas o discos de plástico.
2. Lavado de tubos, bolitas o discos.

Otros métodos de separación incluyen filtración en gel, electroforesis y cromatografía.

Proceso Analítico Detallado

1. Preparación de la muestra y los reactivos:
   • Muestra a temperatura ambiente.
   • Reconstitución de reactivos.
   • Identificación de tubos.
2. Dispensación de volúmenes y reactivos.
3. Incubación:
   • Cada ensayo requiere una incubación determinada.
   • En general, a temperatura ambiente para sensibilidad no muy importante.
   • Para temperatura baja y largo tiempo, aumentan la precisión y reproducibilidad.
4. Separación de fracciones libre y unida:
   • Objetivo: Poder contarlas por separado.
   • Procedimiento: Partición (como se describió anteriormente).
5. Contaje de la radiactividad de las muestras:
   • Generalmente se cuenta la fracción unida.
   • Se expresa en cuentas por minuto (cpm).
   • Lectura en fase líquida mediante:
     • Contador gamma para ¹²⁵I.
     • Contador beta para Tritio (³H).
6. Cálculo de la curva patrón:
   • Es la representación de la relación entre dos variables.
   • Relaciona las medidas de actividad obtenidas frente a las concentraciones conocidas de los patrones.
   • Puede hacerse manualmente o por ordenador.
   • Representación:
     • Eje de ordenadas (Y): Radiactividad obtenida en el complejo Ag*-Ac.
     • Eje de abscisas (X): Concentración de Ag.
   • Hay 3 tipos de gráficas: directa, semilogarítmica y logarítmica.
7. Lectura de los resultados:
   • Se obtiene interpolando la curva patrón con la medida de la radiactividad obtenida.
   • Actualmente, tanto en RIA como en IRMA (Immunoradiometric Assay) están automatizados.
   • Los equipos automatizados realizan:
     • Dispensación automática de reactivos y muestras.
     • Incubación.
     • Lavado de tubos.
     • Contaje de radiactividad.
     • Creación de curva patrón.
     • Lectura de muestras.
8. Control de ensayo:
   • Mediante muestras de control (comerciales o preparadas en laboratorio).
   • Mediante curva patrón (evaluando pendiente y coeficiente de variación).

Contadores de Pozo

Tipos de contadores de centelleo según la naturaleza del sistema fluorescente:

1. Contador de Centelleo Sólido (Contador Gamma):
   • Hecho de cristal de NaI(Tl) (Yoduro de Sodio dopado con Talio).
   • Indicado para contar emisiones gamma.
   • La muestra se sitúa en el tubo de ensayo o de contaje en el interior del cristal que tiene forma de pozo.
2. Contador de Centelleo Líquido:
   • Para emisiones beta (poco poder de penetración).
   • Se utilizan sustancias líquidas centelleantes.
   • Se disuelve la muestra con disolvente fluorescente (tolueno) + fluoróforos primario y secundario para obtener un cóctel de contaje o centelleo.
   • Se introduce el cóctel en el vial.