Fundamentos de Virología: Estructura, Replicación y Diagnóstico de Virus

Los Virus: Agentes Acelulares y su Biología

Estructura Viral Básica

Nucleocápside

• Cápside: Cubierta proteica que rodea el ácido nucleico. Está formada por subunidades proteicas llamadas capsómeros.
• Ácido nucleico: Ácido ribonucleico (ARN) o desoxirribonucleico (ADN), de cadena simple (ss) o doble (ds), según el tipo de virus.

Envoltura o Envuelta Lipídica (en algunos)

Tipos de Virus según la Forma de la Nucleocápside

• Icosaédricos
• Helicoidales

Morfologías Virales Comunes

• Poliédrica (ej. Adenovirus)
• Esférica (ej. Influenza)
• Helicoidal (ej. Virus del mosaico del tabaco)
• Compleja (ej. Bacteriófago)

Ciclo de Replicación Viral

1. Adsorción
2. Penetración
3. Desnudación (o Decapsidación)
4. Síntesis de macromoléculas (Proteínas tempranas/Proteínas Tardías)
5. Ensamblaje viral
6. Liberación (Por brotación o lisis celular)

Fases Detalladas del Ciclo Lítico

1. Adsorción

2. Penetración

• Penetración directa: En algunos virus sin envoltura. P. ej., algunos fagos (T-par). Solo entra el genoma.
• Endocitosis: Frecuente en virus sin envoltura. Consiste en una invaginación de la membrana citoplasmática en el lugar donde se ha adherido el virus. Se forman vacuolas o vesículas que llevan dentro viriones.
• Fusión: En virus con envuelta o envoltura. Fusión entre la envuelta del virus y la membrana de la célula, liberándose la nucleocápside del virus en el citoplasma de la célula.

3. Descapsidación (o Desnudación)

4. Replicación de Ácidos Nucleicos y Síntesis de Proteínas Virales

Retrovirus:

5. Maduración o Ensamblaje

6. Liberación

Clasificación y Nomenclatura Viral

Morfología de la Cápside / Con o Sin Envoltura

• Icosaédricos o helicoidales
• Con envoltura o desnudos

El Tipo de Ácido Nucleico que Contiene

• ADN/ARN
• De cadena doble o sencilla
• De sentido + / -

Su Método de Replicación

• Liberación por brotación o por lisis

Clasificación según el Genoma ARN (Método de Baltimore)

• ARNss (+): Actúa directamente como ARNm durante la replicación viral.
• ARNss (-): Es complementario al ARNm. Necesita de la ARN pol dependiente de ARN para que actúe como ARNm.
• Virus ARN con genoma segmentado (Orthomyxoviridae).
• Virus ARN con dos copias idénticas (Reoviridae).

Patología Viral y Ejemplos Clínicos

Diferencias en la Transmisión según la Envoltura

• Los Virus con envoltura son, en general, más frágiles y más sensibles a las condiciones ambientales. Muchos de ellos necesitan contactos que eviten o reduzcan su exposición al exterior: inoculación transcutánea, picadura de artrópodo, mordedura o inoculación directa en la sangre…
• Los Virus sin envoltura (desnudos) suelen ser más resistentes a la acción de agentes externos, del jugo gástrico y las sales biliares del tubo digestivo; por ello, muchos pueden transmitirse por vía fecal-oral.

Grupos de Virus de Interés Clínico

Virus Respiratorios

Herpesviridae

• Causan gingivoestomatitis, herpes labiales o genitales, varicela/zóster o mononucleosis infecciosa, entre otras enfermedades.
• Persisten en estado latente toda la vida después de la primoinfección, siendo frecuente su reactivación.

Género Influenzavirus o Virus de la Gripe

Antígenos Principales

• Hemaglutinina (H): Participa en la adhesión y penetración del virus al inicio de la infección.
• Neuraminidasa (N): Facilita la liberación de los viriones de la célula infectada.

Variaciones Antigénicas

• Derivas antigénicas: Cambios en la composición antigénica por mutaciones aleatorias. Ocurren todos los años. Producen pequeños cambios, pero no variación de subtipo (lo que dificulta una vacuna válida para largos períodos de tiempo).
• Cambios antigénicos: Variación mucho más grande de las proteínas H y N. Ocurren cada 10-20 años. Causa grandes pandemias, implica cambios de subtipo.

Género Coronavirus

Especies Relevantes

• SARS-CoV: Síndrome respiratorio agudo grave/severo (2002-2003). 8000 casos. 10% mortalidad. Asia, Europa, América del N y S. Transmisión zoonótica; ¿murciélagos?
• MERS-CoV: Síndrome respiratorio de Oriente Medio (2012).
• SARS-CoV-2 (2019): La COVID-19.

SARS-CoV-2: Diagnóstico de Laboratorio

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Familia Herpesviridae

• ADN bicatenario.
• Cápside icosaédrica, rodeada por una estructura proteica amorfa llamada Tegumento.
• Envoltura lipoproteica con proyecciones glucoproteicas.
• Inestables a T° ambiente.
• Se inactivan fácilmente por disolventes lipídicos.
• La infección primaria ocurre generalmente en la infancia de modo subclínico (excepto el VHS-2 que se transmite sexualmente).
• Tras la primoinfección, permanecen latentes en el organismo, persistiendo de por vida.
• Son mantenidos bajo control por el sistema inmune, que no es capaz de erradicarlos.
• Pueden reactivarse, especialmente en inmunodeprimidos.

Virus de la Hepatitis

Virus de la Hepatitis B (VHB)

Diagnóstico Laboratorio Hepatitis B Aguda con Recuperación

• HBs Ag y HBe Ag son los primeros marcadores que aparecen antes del comienzo de los síntomas.
• El HBsAg alcanza su máximo al comienzo de los síntomas y persiste 1-5 meses.
• El HBeAg desaparece antes que el HBsAg y da lugar a anti-HBe.
• A veces el anti HBc es el único marcador positivo, porque el intervalo entre la desaparición del HBsAg y la aparición del anti-HBs, puede ser de hasta 6 meses.
• En la rutina diaria, el HBsAg y el anti-HBc (total), son los principales marcadores para el diagnóstico de la infección.
• El HBsAg es la base del cribado de hemodonaciones en el banco de sangre y de la detección de portadores entre mujeres gestantes.

Diagnóstico Laboratorio Hepatitis B Crónica

Fase Replicativa:

• Hipertransaminasemia sostenida;
• El HBsAg, Ac anti-HBc, HBeAg, el DNA VHB y la DNA pol SON POSITIVOS.

Fase No Replicativa:

• Las Transaminasas descienden a valores casi normales;
• El HBeAg se negativiza y aparece el Anti-HBe (remisión).
• DNA VHB y DNA pol NEGATIVOS.
• El HBsAg desciende, pero habitualmente permanece de por vida.
• HBsAg persiste más de 6 meses + evidencia clínica de hepatitis.
• Ausencia de anti-HBs.

Diagnóstico de Laboratorio Hepatitis B en Resumen:

• H. aguda: Ag HBs, Ac HBc IgM. (infección actual).
• H. crónica: AgHBs > 6 meses sin Ac HBs, Ag HBe > 3 meses.
• Si desaparece Ag HBe y aparecen Ac HBe: H. crónica con seroconversión y evolución favorable.
• Estado inmunitario: Ac anti- HBs.
• Estado infectivo (indica transmisibilidad): Ag HBe. Se localiza en el core, hay virus en sangre.
• Estudio de evolución: Ag HBe, Ac anti- HBe.
• Replicación viral activa: Ag HBe y ADN.

VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana

Estructura del VIH

• Envoltura externa: Doble capa lipídica procedente de la célula infectada.
• Glucoproteínas: gp-120 y gp-41.
• Por dentro de la membrana: Proteína p-17.
• Nucleocápside: Con proteína p-24.
• Transcriptasa inversa: Asociada al ARN.
• Genoma: 2 moléculas idénticas de ARN.

Mecanismo de Infección

1. Interacción de la gp-120 viral con receptores CD4 presentes principalmente en linfocitos Th (CD4) y en menor proporción en monocitos macrófagos y células gliales cerebrales.
2. La envoltura viral se une a la membrana citoplasmática por medio de la gp-41.
3. Liberación del virus al citoplasma. Pierde la cápside, y el ARN, mediante la transcriptasa inversa origina un ADN circular que puede:
   • Quedar en el citoplasma. Posible efecto citopático.
   • Pasar al núcleo, integrándose en el cromosoma, donde puede:
     • Permanecer latente.
     • Replicarse lentamente.
     • Replicarse rápidamente: originando lisis celular.

Infección por VIH y SIDA

VIH: Diagnóstico de Laboratorio

Indirecto: Marcadores Serológicos del VIH

Prueba de cribado o screening:

• Detección de Acs anti-VIH por EIA de 3ª/4ª gen.
• En hemodonaciones, control serológico de embarazadas y diagnóstico inicial.
• Detectan Acs frente a VIH-1 y VIH-2.
• La presencia de Acs VIH lejos de reflejar exposición y protección inmune, indica estado de portador actual del virus.

Pruebas de confirmación:

La prueba de confirmación que se realiza tras un resultado positivo en las pruebas de screening es el WESTERN BLOT.

Este método discrimina bandas correspondientes a diversos tipos de Acs dirigidos frente a diferentes proteínas antigénicas codificadas por tres de los genes principales del VIH-1: env, gag y pol.

La interpretación del WB para el VIH según la OMS:

• Positivo: Presencia de, al menos, 2 bandas de envoltura.
• Negativo: Ausencia de bandas.
• Indeterminado: El resto de los patrones.

Las causas de un WB indeterminado pueden ser: infección por VIH 2, fase de seroconversión, enfermedad avanzada, etc.

Diagnóstico del VIH Directo

Antigenemia

• Determinación del Ag p-24 en suero por ELISA. Indicaciones:
  • Diagnóstico precoz. Periodo ventana.
  • Seguimiento evolutivo de la infección.
  • Monitorización del tratamiento antirretroviral (disminución de la antigenemia = buena respuesta terapéutica).
  • Valoración de la infectividad. La antigenemia se correlaciona con mayor probabilidad de contagio.

Pruebas genéticas

• Determinación de ADN proviral integrado en el genoma de los linfocitos, por PCR. Es indicativo de infección, pero no informa sobre el grado de replicación del virus.
• Cuantificación de la carga viral (RNA-VIH) circulante en sangre (viremia) copias/ml, por: RT-PCR, NASBA o ADN ramificado.

Las indicaciones para determinar la CVP (carga viral plasmática) son:

• Monitorización del tto antirretroviral. La CVP debería ser indetectable (<50 copias/ml) entre las 16-24 semanas de inicio del tto.
• Predicción de progresión en pacientes crónicos e indicación de inicio del tto.
• Valoración del riesgo de transmisión. (>CVP >riesgo).
• Diagnóstico de infección aguda. Replicación máxima del virus a los 10 días post-infección.

Virus del Papiloma Humano (VPH)

Métodos de Diagnóstico Virológico

Complejidad del Diagnóstico

Selección, Obtención y Procesamiento de Muestras

Deben obtenerse lo más rápido posible una vez iniciada la enfermedad.

• Una petición adecuada incluye el tipo de muestra y los virus sospechados.
• Las muestras se transportarán refrigeradas al laboratorio y procesarán lo antes posible.
• El procesamiento debe realizarse con guantes y no debe abrirse más de una muestra a la vez para evitar la contaminación cruzada.
• Cada laboratorio establece sus protocolos de diagnóstico.

Examen Directo

Microscopía Óptica

Este tipo de prueba se denomina test de Tzanck (TT).

Para el diagnóstico de herpesvirus (especialmente en inmunodeprimidos -ID-):

• Se usa como muestra el contenido líquido de las vesículas herpéticas o frotis de la base de lesiones ulcerocostrosas.
• La muestra se fija y se tiñe con Giemsa o azul de toluidina.
• Observar al microscopio el efecto citopático (formación de células gigantes multinucleadas).

Microscopía Electrónica

Microscopía de Fluorescencia

Técnica empleada: inmunofluorescencia; en ella se emplean anticuerpos marcados con fluorescencia que son específicos de antígenos virales.

Técnica de examen microscópico directo, puesto que se observan directamente los tejidos infectados con virus.

Permite detectar muchos tipos de virus.

Tipos:

• Inmunofluorescencia directa.
• Inmunofluorescencia indirecta.

Cultivo Celular

Tipos de Cultivos Celulares

• Cultivos celulares primarios
• Líneas celulares: líneas celulares continuas y semicontinuas

La mayoría de líneas celulares pueden obtenerse comercialmente o en colecciones como la ATCC (American Type Culture Collection).

Mantenimiento de Cultivos Celulares

Los cultivos celulares son tejidos “vivos” y, por lo tanto, tienen que subcultivarse para mantener su viabilidad (“pases”).

Estas células se disponen en monocapa adheridas al lecho del tubo o frasco, manteniéndose con unos medios líquidos, con tampones, suplementos nutritivos como albúmina, vitaminas, etc. (suero fetal bovino), y antibióticos para evitar la contaminación bacteriana.

Todo ello a temperatura y humedad controladas. Los tiempos de incubación son largos, con un promedio de 15 días. Pueden clasificarse en:

• Cultivos celulares primarios: Se obtienen de tejidos normales, con varios tipos de células, de cariotipo normal y de crecimiento limitado in vitro. Resisten entre 5-10 subcultivos. Son muy poco selectivos, permitiendo el crecimiento de casi todos los virus. Ej: células de riñón embrionario humano (REH), fibroblastos de pulmón humano…
• Líneas celulares continuas: Células inmortalizadas en el laboratorio, resisten un número n de pases. Son células neoplásicas procedentes de tumores malignos. Ej: Vero (de riñón de mono verde africano), HeLa y HEp-2 (derivadas de células humanas malignas). Tienen un nº variable de cromosomas, por eso a veces se denominan líneas celulares heteroploides. Son bastante selectivos con el crecimiento vírico.

Uso de los Cultivos Celulares: Efecto Citopático

En el microscopio óptico no se observan los virus, sino el efecto que producen en las células hospedadoras o efecto citopático (ECP): modificación de la morfología habitual de las células inoculadas que variarán en función del tipo de virus.

También se puede llevar a cabo una titulación. El título o carga viral es la cantidad de partículas virales por unidad de volumen presentes en una muestra.

Una vez que la monocapa se inocula con una muestra de un individuo infectado, el virus se pone de manifiesto por el desarrollo de un efecto celular morfológico degenerativo visible: Efecto Citopático (ECP):

• Formación de sincitios (células multinucleadas resultado de la fusión de varias células).
• Formación de vesículas.
• Formación de inclusiones.
• Redondeamiento celular.
• Desprendimiento de la monocapa celular.

Efecto Citopático del CMV: Células en Ojo de Búho

Cambios morfológicos y estructurales que produce en las células infectadas, caracterizados por células grandes y redondeadas con un gran núcleo que contiene inclusiones basófilas (“ojo de búho”), visibles al microscopio, lo que lleva a la pérdida de función celular y daño tisular, manifestándose en síntomas como mononucleosis o, más gravemente, en pacientes inmunodeprimidos, afectaciones como retinitis, hepatitis o neumonitis.

Técnica de Ensayo en Placa para la Titulación Viral

• Emplea cultivos celulares cuya monocapa se infecta con diluciones seriadas de la suspensión del virus a titular.
• Tras 2-3 h de incubación, se cubre la monocapa con un medio semisólido, que evitará que las nuevas partículas virales que se vayan formando, se propaguen por toda la monocapa celular.
• Tras 2-3 ciclos de infección, alrededor de cada célula infectada, se observará una placa de lisis (o Unidad Formadora de Placa, UFP).

Para diferenciar las células infectadas de las no infectadas, se emplean colorantes citológicos que teñirán las células no infectadas. De esta forma, las placas podrán contarse fácilmente y el título se expresará en UFP/ml.

Cultivo Celular Acelerado en Shell Vial

• Cultivo Celular en tubos especiales Shell-vial.
• La muestra se deposita en estos tubos y se realiza una centrifugación a baja velocidad.
• La centrifugación acelera la adherencia y la penetración del virus a la célula receptora, lo que permite en 48 h de incubación, identificar proteínas del virus mediante Acs monoclonales específicos marcados con fluoresceína.
• Ej: Virus influenza A y B, VRS, Adenovirus, CM.

Técnicas Inmunológicas

Métodos inmunológicos indirectos de detección de la respuesta inmunitaria humoral específica del paciente frente a un virus.

Ensayos Serológicos

• Reacción de fijación del complemento.
• Inhibición de la hemaglutinación.
• Reacción de neutralización.

Técnicas Inmunológicas Directas/Mixtas

• Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
• Inmunocromatografía.
• Western blot o inmunoelectrotransferencia.

Técnicas de Biología Molecular

Son técnicas moleculares para el diagnóstico virológico; consisten en la detección o análisis de ADN o ARN viral. Muy valiosas en virología debido a que poseen:

• Gran sensibilidad.
• Especificidad.
• Reproducibilidad.

No son capaces de evaluar la viabilidad y la capacidad infectiva de los virus.