Fundamentos y Variantes de la PCR: Replicación del ADN y Técnicas de Amplificación Genética

Variantes y Fundamentos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

PCR Anidada (Nested PCR)

El producto de la amplificación primaria se utiliza como molde para realizar dos amplificaciones sucesivas. Esta técnica ofrece alta sensibilidad y especificidad, ya que los cebadores internos solo podrán hibridar en el sitio interior del amplicón generado en la primera reacción.

PCR In Situ

Reacción directa realizada con los tejidos o células. Se realiza primero la amplificación del ADN blanco y luego la detección mediante hibridación in situ convencional con sonda ADN/ARN. Por ende, esta técnica detecta cantidades muy pequeñas de genoma.

PCR Múltiple (Multiplex PCR)

Permite amplificar más de una secuencia objetivo simultáneamente. Se combinan dos o más pares de cebadores en el mismo mix de reacción. Requiere un riguroso análisis de los cebadores para evitar la generación de dímeros y estructuras secundarias indeseadas.

RT-PCR (PCR con Transcripción Reversa) y PCR en Tiempo Real (qPCR)

• RT-PCR: Detecta ARN mensajero (mRNA). Realiza una transcripción reversa, generando ADN complementario (ADNc) a partir del molde de ARN.
• PCR en Tiempo Real (qPCR): Es una variación de la reacción de PCR que permite cuantificar las cantidades de ADN o ARN presentes en la muestra original. Utiliza técnicas basadas en fluorocromos no específicos y sondas específicas.

Fundamentos de la Biología Molecular: ADN y ARN

ADN (Ácido Desoxirribonucleico)

Molécula de doble cadena que contiene las instrucciones genéticas para el desarrollo, funcionamiento y reproducción de los organismos vivos.

Está compuesta por nucleótidos, formados por:

• Una base nitrogenada (Citosina, Guanina, Adenina o Timina).
• Un azúcar (Desoxirribosa).
• Un grupo fosfato.

ARN (Ácido Ribonucleico)

Molécula de cadena simple presente en todas las células y en algunos virus.

Está formada por ribonucleótidos, que contienen:

• Bases nitrogenadas (Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo).
• Ribosa.
• Fosfato.

Desempeña roles esenciales en la síntesis proteica y la regulación génica.

Replicación del ADN

La replicación del ADN es un proceso fundamental y semiconservativo:

• Cada hebra parental sirve de molde para una nueva hebra complementaria.
• El resultado son dos dobles hélices, cada una con una hebra original y una hebra recién sintetizada.
• Comienza en un punto específico llamado origen de replicación.
• La enzima Helicasa desenrolla y separa las hebras de ADN, las cuales son estabilizadas por proteínas.
• La ADN Polimerasa añade nucleótidos a una cadena preexistente, iniciada por un cebador de ARN.
• Las hebras se replican de manera continua (hebra líder) y discontinua (hebra rezagada), formando los fragmentos de Okazaki, que luego se unen para formar una cadena continua.

Metodología y Aplicaciones de la PCR

Metodología de Laboratorio

1. Obtención del ADN Molde: Resuspender la colonia bacteriana en agua destilada estéril, hervir la muestra y usar el sobrenadante como molde (templado) para la amplificación.
2. PCR (Amplificación de Genes de Virulencia): Preparación de la mezcla de reacción que contiene Master Mix, cebadores (primers), molde y agua. Se sigue un protocolo detallado para la preparación de la mezcla y el programa del termociclador.
3. Visualización de Amplificados (Geles de Agarosa): Preparación de gel de agarosa al 0.8%, carga de muestras de PCR, electroforesis y visualización en transiluminador.

Objetivo Principal de la PCR

El objetivo principal de la PCR es identificar genéticamente organismos o patógenos presentes en una muestra. En el contexto del laboratorio educativo, su finalidad es aprender la metodología y fundamentos de la PCR para la identificación de bacterias en muestras.

Aclaración sobre la Estructura del PCR

¿Por qué el PCR es de una simple cadena? El PCR no es una molécula de simple cadena; más bien, la técnica de PCR trabaja con moléculas de ADN de doble cadena que se desnaturalizan (separan) en cada ciclo para permitir la síntesis de nuevas cadenas.