Fundamentos y Tipos de Cromatografía Bioquímica

Tipos de Cromatografía

Cromatografía de Elución

La muestra se introduce en la columna y el eluyente fluye por ella. Los constituyentes se separan en fase móvil y fase estacionaria y se retardan según su mayor o menor retención en la fase estacionaria.

Cromatografía de Desplazamiento

Se introduce la muestra en la columna y se usan diversos eluyentes. El eluyente 1 queda más retenido que A y B, pero menos que C. Se desplaza A y B. El uso del eluyente 2, con mayor retención que C, desplaza a C.

Cromatografía de Permeación de Gel (Exclusión Molecular)

Las moléculas grandes no entran en el poro de la fase estacionaria y se mueven más rápido a través del lecho. Los soportes típicos son geles de polidextrano.

Cromatografía de Interacción Hidrofóbica

Separa compuestos debido a distintas interacciones hidrofóbicas con una matriz no cargada con grupos hidrofóbicos.

Cromatofocalización

Variedad de IEX. Las proteínas eluyen en función del pH. Se utiliza una columna de intercambio iónico equilibrada a un pH dado.

Cromatografía de Afinidad

Interacción específica y reversible entre la proteína y un ligando específico unido a la matriz cromatográfica. El soporte tiene un ligando específico. Las sustancias de la mezcla interaccionan específicamente con el ligando y quedan retenidas.

Cromatografía de Afinidad (AC)

Ligandos unidos covalentemente a la matriz y con alta capacidad para unirse a la proteína (posible brazo espaciador).

Parámetros y Principios

La distribución de concentración de una sustancia a la salida de una separación cromatográfica es determinada por parámetros termodinámicos e hidrodinámicos. Se obtienen gráficas de concentración de salida en función del volumen eluido o del tiempo.

• Matriz: Sustancia con la que se empaqueta la columna.
• Eluyente: Disolución tamponada que se emplea para transportar el soluto a través de la fase estacionaria.
• Vt: Volumen total del cilindro de gel hidratado.
• Vo: Volumen entre las esferas de gel (volumen de exclusión).
• Vr: Volumen de retención. Volumen de fase móvil necesario para transportar el soluto desde el punto de inyección hasta el detector, a través de la columna.

Tipos de Elución

• Elución Isocrática: Composición constante del eluyente.
• Elución en Gradiente: La composición del medio eluyente se modifica.

Soportes Cromatográficos

• Inorgánicos: Sílica porosa, vidrio de poro controlado, hidroxiapatita.
• Sintéticos: Poliacrilamida, poliestireno.
• Polisacáridos: Celulosa, dextrano, agarosa.
• Polímeros Orgánicos (Sacáridos): Agarosa, dextrano, poli(N-isopropilacrilamida).

Cromatografía de Intercambio Iónico (IEX)

Se basa en enlaces reversibles entre componentes iónicos de la fase móvil y la fase estacionaria. La proteína desplaza a un ion de bajo peso molecular que se encuentra unido a la matriz de intercambio iónico. La proteína debe tener carga neta y un pH que difiera en una unidad respecto a la matriz y la proteína con carga opuesta.

La elución de la proteína unida a la matriz implica romper las interacciones electrostáticas proteína-matriz.

Problemas Comunes en Cromatografía

La proteína no es retenida en la matriz:

• Fuerza iónica inicial muy alta.
• pH de la columna no adecuado.
• Columna no equilibrada adecuadamente.

Bajo rendimiento (< 60-80%):

• La proteína permanece retenida  Requiere fuerza iónica mayor.
• pH de la columna no adecuado (p.ej., muy diferente del pI, la proteína se une muy fuertemente a la columna).
• Se ha perdido cofactor (en enzimas).
• Hay proteasas en la preparación (proteólisis).

Baja resolución:

• Flujo muy rápido.
• Columna muy corta.
• Se ha cargado mucha proteína en la columna.
• La pendiente del gradiente de elución es muy inclinada.

Pérdida de actividad:

• Se ha perdido un cofactor.
• Proteína no estable en condiciones de elución (pH, temperatura...).

Aumento de la actividad:

• Se ha eliminado un inhibidor.

Consideraciones Adicionales

MLPC: Presión entre 6 y 50 bar, matriz rígida, mayor flujo.

HPLC: Presión +50 bar, matriz rígida, partículas pequeñas.