Fundamentos de la Tinción Celular y Técnicas de Contraste en Microscopía Óptica

Tipos de Colorantes y su Interacción Celular

Casi todos los colorantes son sales en disolución, es decir, aniones y cationes que van a reaccionar de alguna manera con el espécimen. Según la carga del ion que tiñe, se clasifican en:

Colorantes Básicos y Ácidos

• Colorantes Básicos: Son aquellos en los que el agente que tiñe es el ion cargado positivamente (catión). Son los más utilizados, ya que la mayoría de las células microbianas poseen cargas negativas débiles en su superficie, lo cual facilita su unión.
• Colorantes Ácidos: Son aquellos en los que el colorante es el ion cargado negativamente (anión).

Entre los colorantes básicos más comunes se encuentran el azul de metileno, la fucsina básica, la eosina y el Rojo Congo.

Mordientes: Intensificadores de la Tinción

Otras sustancias que se utilizan en las tinciones son los mordientes. No son colorantes, pero tienen gran importancia en algunas técnicas de tinción, ya que intensifican la tinción al aumentar la afinidad de la célula por el colorante. También se utilizan para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados de otra manera.

Microscopía Óptica: Técnicas de Contraste sin Colorantes

Los microscopios compuestos pueden ser modificados mediante distintas técnicas para aumentar el contraste entre la muestra y el fondo sin necesidad de usar colorantes. Esto da lugar a la existencia de varios tipos de microscopios ópticos modificados:

1. Microscopía de Contraste de Fases

   Se utiliza para el estudio de células vivas y en investigaciones biológicas. Se basa en el hecho de que las ondas de luz sufren un desfase (son retardadas) al atravesar una muestra con índice de refracción distinto al del medio que la rodea. El microscopio de contraste de fases incorpora unos objetivos y un condensador especiales que amplifican el desfase de las ondas y las convierte en diferentes intensidades de luz que ya son visibles a través de los oculares. De esta manera, proporciona una imagen clara y detallada de las células vivas sin teñir sobre un campo más oscuro que el microscopio normal. La mayor ventaja que ofrece es poder estudiar el movimiento y las estructuras celulares internas que, mediante esta técnica, no son distorsionadas por la fijación y la tinción.

2. Microscopía de Campo Oscuro

   Presenta un condensador especial que desvía los rayos de luz para que no entren directamente en el objetivo. Sin embargo, aquellos rayos que atraviesan la muestra serán desviados y sí alcanzarán el objetivo. El resultado es una imagen brillante con bastante resolución sobre un fondo oscuro. Permite visualizar células vivas sin teñir y se usa sobre todo para la observación de estructuras externas (ejemplo: flagelos).

3. Microscopía de Fluorescencia

   En esta técnica, el contraste aumenta por medio de la fluorescencia, que es una propiedad que tienen algunos compuestos químicos de absorber la luz de una determinada longitud de onda y de devolverla con una longitud de onda mayor. Si se iluminan materiales fluorescentes con luz ultravioleta (invisible), devuelven luz brillante sobre fondo oscuro. La fluorescencia depende del espécimen, no del microscopio. Por ello, solo se podrían observar microorganismos que sean fluorescentes por sí mismos o que hayan sido teñidos con fluorocromos.