Fundamentos y Técnicas Avanzadas de Microscopía para la Investigación Biológica

1. Tipos de Objetivos y su Relación con el Ajuste de Iluminación

Objetivo seco débil (10x):

Requiere **baja** iluminación.

Objetivo seco fuerte (40x):

Requiere **media** iluminación.

Objetivo de inmersión (100x):

Requiere **alta** iluminación.

2. Uso y Propósito de los Objetivos de Inmersión

1. Tras realizar los pasos del **enfoque inicial**, se deposita una pequeña gota de **aceite de inmersión** sobre la zona de preparación que se desea observar.
2. Colocar el **objetivo de inmersión** en el **eje óptico** del microscopio.
3. Situar la gota en el **eje óptico** manejando los **tornillos de desplazamiento**.
4. Acercar la preparación al objetivo con el **tornillo macrométrico**, sin mirar por el ocular, hasta que la gota haga contacto con la lente del objetivo, aproximándola al máximo, sin que el objetivo llegue a tocar la preparación.
5. Ajustar la **iluminación** acercando el **condensador** a la preparación y abriendo el **diafragma**.
6. Mirando por el ocular, alejar con el **tornillo macrométrico** la preparación lentamente, hasta que se obtenga imagen.
7. Ajustar la **iluminación**.

3. Normas Fundamentales para el Uso del Microscopio

• Mantener la **platina** limpia y seca.
• No tocar las **lentes** con los dedos.
• Los **objetivos de inmersión** no deben usarse en seco.

4. Técnicas de Observación en Fresco de Microorganismos

• **Cámara húmeda**.
• **Gota pendiente**.

5. Explicación de la Técnica de la Gota Pendiente

La técnica de la **gota pendiente** se realiza depositando una gota o suspensión de la muestra en el centro de un **cubreobjetos**, y colocando encima de dicha gota el hueco de un **porta excavado**. Posteriormente, se gira el conjunto y la gota quedará pendiente del cubre.

6. Técnica de la Coloración Vital

La **coloración vital** se emplea para poder visualizar ciertas estructuras de los **microorganismos** sin producirles la muerte de forma inmediata. Con este fin, se emplean colorantes a muy bajas concentraciones para disminuir su **efecto tóxico**, como el **rojo neutro** y el **azul de metileno**.

Se realiza preparando una **cámara húmeda** y añadiendo el colorante por el borde del cubre. Se observa al **microscopio óptico** con **objetivos de 10x y 40x**. Los **colorantes vitales**, a la larga, producen la **muerte celular**, pero durante un cierto tiempo permiten la observación del microorganismo en **estado vivo**.

7. Fases Ordenadas de una Tinción

1. **Extensión**.
2. **Desecación**.
3. **Fijación**.
4. **Tinción**.
5. **Desecación**.
6. **Observación**.

8. Realización de la Fijación y la Desecación

Fijación: Puede hacerse tanto por **agentes físicos** como por el **calor**, pasando el **portaobjetos** de forma rápida dos o tres veces por la **llama de un mechero**.

Desecación: Se deja secar la extensión a **temperatura ambiente**, o bien se acerca a una llama pero sin ponerla encima de esta.

9. Clasificación de las Tinciones según su Origen

• **Naturales**.
• **Artificiales o sintéticos**.