Fundamentos de Sondas Moleculares, Expresión Génica y Transformación con T-DNA en Biología Molecular

Sondas Moleculares: Definición y Aplicaciones

Una sonda molecular es un fragmento de ADN de doble cadena que, para su uso, debe ser desnaturalizado. Esta sonda posee una región específica que puede ser marcada mediante diversos métodos: marcaje radiactivo, marcaje isotópico, marcaje fluorescente o a través de una reacción colorimétrica.

Aplicaciones Principales de las Sondas

• Southern blot
• Northern blot
• Hibridación in situ

Técnicas para el Estudio de la Expresión Génica

Fusión de Promotores a Genes Informadores

Consiste en la fusión de la región promotora del gen de interés al gen de la β-glucuronidasa (GUS). En presencia del sustrato X-Gluc, la actividad de esta enzima produce una coloración azul, indicando la actividad del promotor.

Northern Blot

En esta técnica, se extrae el ARN total de la muestra, se separa mediante electroforesis en gel de agarosa y se transfiere a una membrana. Posteriormente, se hibrida con una sonda específica para el gen de interés. La presencia e intensidad de las bandas reveladas indican el nivel de expresión del gen en la muestra de ARN.

RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa)

Se extrae el ARN y se convierte en ADN complementario (ADNc) utilizando una enzima retrotranscriptasa y cebadores específicos. El ADNc resultante se amplifica mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). La comparación de la cantidad de producto amplificado (bandas en un gel o cuantificación en tiempo real) permite evaluar los niveles de expresión génica.

Microarrays de ADN

Son colecciones de miles de sondas de ADN (pequeños puntos o spots) fijadas sobre una superficie sólida (portaobjetos de vidrio o chip). Sobre estos microarrays se hibridan muestras de ARN o ADNc marcados, lo que permite el estudio simultáneo de la expresión de miles de genes en diferentes condiciones experimentales.

RNA-Seq (Secuenciación de ARN)

Implica la extracción del ARN total de la muestra problema y de una muestra control (por ejemplo, una estirpe silvestre). Posteriormente, se realiza una secuenciación masiva de estos ARNs (generalmente convertidos a ADNc). El análisis comparativo de las secuencias permite identificar qué genes se encuentran sobreexpresados o subexpresados (silenciados) en la muestra de estudio en relación con el control.

El T-DNA: Estructura, Función y Ventajas en Transformación Genética

El T-DNA (ADN de transferencia) es una porción específica y bien definida del plásmido Ti (inductor de tumores) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens.

Cuando el T-DNA se integra en el genoma de una célula vegetal, los genes que originalmente contiene (en su forma natural, no modificada para ingeniería genética) pueden inducir la división y proliferación celular descontrolada, llevando a la formación de tumores (agallas de corona).

Organización del Plásmido Ti y el T-DNA

El T-DNA es el segmento del plásmido Ti que se transfiere e integra en el genoma de la planta. Este segmento está delimitado por secuencias específicas conocidas como borde derecho y borde izquierdo. Dentro del T-DNA natural se encuentran genes responsables de:

• La síntesis de fitohormonas (auxinas y citoquininas), cuya producción en la célula vegetal provoca la división celular descontrolada y la formación de tumores.
• La síntesis de opinas, que son compuestos derivados de aminoácidos que Agrobacterium utiliza como fuente de carbono y nitrógeno.

Otras regiones importantes del plásmido Ti, pero que no se transfieren a la planta, son:

• La región de virulencia (genes vir): Contiene los genes cuyas proteínas son esenciales para el proceso de escisión, transferencia e integración del T-DNA en la célula vegetal.
• La región de catabolismo de opinas: Permite a la bacteria metabolizar las opinas producidas por la planta transformada.

Ventajas de la Transformación Mediada por T-DNA (Agrobacterium) frente a la Microproyección

• No requiere el uso de partículas inertes (como tungsteno u oro) necesarias en la microproyección (biobalística), lo que puede reducir los costos asociados a estos materiales.
• Generalmente, implica protocolos menos exigentes en cuanto a cuidados post-transformación, como el trasplante y aclimatación de tejidos, en comparación con algunos métodos de microproyección que pueden causar mayor daño tisular.
• Permite la transferencia de segmentos de ADN más grandes y definidos con menor incidencia de reorganizaciones o fragmentaciones del transgén en comparación con la microproyección.
• Suele resultar en un menor número de copias del transgén integradas, lo que puede ser ventajoso para evitar el silenciamiento génico y obtener patrones de expresión más predecibles.