Fundamentos y Protocolos de Tinciones Bacterianas (Gram y Ziehl-Neelsen) y Medios de Cultivo

Tinción de Gram

La **Tinción de Gram** es la tinción diferencial más utilizada en microbiología. Es un procedimiento que proporciona información sobre la morfología, el tamaño y el agrupamiento bacteriano. Divide a las bacterias en dos grandes grupos según el color que adquieren con esta técnica: bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas. Esta diferente respuesta a la tinción pone de manifiesto la diferencia en la composición y estructura de las paredes bacterianas.

Fundamento de la Tinción de Gram

1. **Tinción** con un colorante catiónico (cristal violeta) capaz de unirse a la pared bacteriana y con un mordiente (yodo/Lugol) formando un complejo insoluble.
2. **Decoloración** con una mezcla de alcohol/acetona en proporción 1:1. La mezcla alcohol/acetona es un solvente capaz de disolver la membrana externa (en Gram negativas) y extraer rápidamente el colorante.
3. **Coloración de contraste** con un colorante rojo (safranina o fucsina).

Protocolo de la Tinción de Gram

1. Cubrir la extensión con solución de **cristal violeta** e incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente.
2. Lavar brevemente con agua destilada y escurrir el portaobjetos. (Nota: El lavado debe ser breve, ya que un lavado excesivo puede decolorar las bacterias).
3. Cubrir el portaobjetos con **Lugol** e incubar.
4. Lavar con agua destilada.
5. Cubrir el portaobjetos con una mezcla de alcohol/acetona (1:1) durante 30 segundos (decoloración).
6. Lavar con agua destilada y escurrir el portaobjetos.
7. Cubrir el portaobjetos con una solución de **safranina** e incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente (coloración de contraste).
8. Lavar abundantemente con agua destilada y dejar secar a temperatura ambiente.
9. Visualizar al microscopio.

Tinción de Ziehl-Neelsen

La **Tinción de Ziehl-Neelsen** es una tinción diferencial que permite distinguir un grupo especial de bacterias cuya pared presenta resistencia a la decoloración por una mezcla de ácido y alcohol: las **BAAR** (Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes). Tienen gran importancia porque entre las BAAR se encuentran las micobacterias, que no se tiñen adecuadamente con otras tinciones. Una práctica muy común asociada a esta tinción es la baciloscopia, utilizada para diagnosticar tuberculosis pulmonar.

Fundamento de la Tinción de Ziehl-Neelsen

1. **Tinción en caliente** con un colorante básico como la **fucsina fenicada**. Las BAAR tienen en su pared ácidos micólicos y ceras que confieren un carácter hidrofóbico e impiden el paso del colorante. Inicialmente, todas las bacterias se tiñen de rojo.
2. **Decoloración en frío** con una mezcla ácido-alcohol. Con el frío, los ácidos micólicos y las ceras de la pared de las BAAR vuelven a solidificar, atrapando el colorante (fucsina).
3. **Coloración de contraste**: El colorante de contraste es el **azul de metileno**.

Protocolo de la Tinción de Ziehl-Neelsen

1. Cubrir el portaobjetos con **fucsina fenicada** y calentar el portaobjetos por debajo, lenta y progresivamente, con un mechero hasta que el colorante emita vapores sin llegar a hervir.
2. Dejar que se enfríe y repetir el calentamiento 2-3 veces.
3. Lavar con agua destilada (arrastrando el papel, si se usó).
4. Decolorar con alcohol-clorhídrico durante 2 minutos a temperatura ambiente.
5. Lavar con agua destilada y escurrir.
6. Cubrir el portaobjetos con una solución de **azul de metileno** e incubar.
7. Lavar con agua destilada.
8. Visualizar al microscopio.

Clasificación de Medios de Cultivo

Tipos de medios de cultivo atendiendo a su estado físico:

• **Medios sólidos:** Son medios que contienen un agente solidificante (generalmente agar) en proporción de 12-15 g/L.
• **Medios semisólidos:** Son medios que contienen un agente solidificante en proporción de 2-4 g/L.
• **Medios líquidos (caldos):** Son medios que no contienen ningún agente solidificante.

Tipos de medios de cultivo atendiendo a su composición:

• **Medios químicamente definidos:** Se conocen con exactitud su composición y la concentración de cada uno de los nutrientes.
• **Medios complejos o indefinidos:** No se conocen con exactitud la composición ni la concentración de los nutrientes.

Tipos de medios de cultivo atendiendo a su uso:

• **Medios comunes:** Contienen los nutrientes básicos para el crecimiento de las bacterias que no presentan requerimientos especiales.
• **Medios enriquecidos:** Son medios comunes suplementados con sustancias nutritivas, diseñados para el crecimiento de bacterias exigentes.
• **Medios selectivos:** Incluyen sustancias que inhiben el crecimiento de un tipo de microorganismo, favoreciendo el de otros.
• **Medios diferenciales:** Incluyen sustancias que permiten diferenciar bacterias (por ejemplo, por su actividad metabólica). Se usan en procesos de identificación bacteriana.
• **Medios de enriquecimiento:** Es un medio (siempre líquido) que favorece el crecimiento de una especie determinada.
• **Medios de transporte y mantenimiento:** Se emplean en la recogida, transporte y conservación de muestras biológicas. Son medios que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas.