Fundamentos y Procedimientos de Técnicas Cromatográficas: Intercambio Iónico, Afinidad, Capa Fina, Columna y HPLC

Procedimientos Iniciales de Elución en Cromatografía de Intercambio Iónico y de Afinidad

Para iniciar la elución en estas técnicas, se debe cambiar el pH o aumentar la concentración del contraión en el eluyente y hacerlo pasar a través de la columna.

Procedimiento de Cromatografía de Capa Fina y Columna Abierta

Cromatografía de Capa Fina (TLC)

1. En la cámara cromatográfica, añadir el eluyente para que la atmósfera se sature con sus vapores.
2. Marcar una línea de aplicación en la placa cromatográfica, aproximadamente a 1,5 cm del borde inferior.
3. Aplicar (sembrar) la muestra sobre la línea marcada.
4. Introducir la placa en la cámara, asegurándose de que el nivel del eluyente quede por debajo de la línea de aplicación (entre 0,5 y 1 cm).
5. Permitir que el eluyente ascienda por capilaridad, arrastrando los analitos a diferentes velocidades según su afinidad por la fase estacionaria y móvil.
6. Retirar la placa cuando el frente del eluyente alcance la altura indicada en el protocolo y dejar secar.
7. Interpretar los resultados (calcular Rf) o revelar las manchas mediante tinción si los compuestos no son visibles.

Cromatografía en Columna Abierta

1. Con la columna dispuesta verticalmente, añadir la muestra en la parte superior.
2. Añadir el eluyente, que descenderá por gravedad arrastrando la muestra a través de la fase estacionaria.
3. Los distintos componentes de la muestra se separarán y saldrán secuencialmente por la parte inferior de la columna.
4. Recoger las fracciones eluídas en diferentes tubos para su posterior identificación y cuantificación.

Identificación y Cuantificación en Cromatografía de Capa Fina y Columna Abierta

Cromatografía de Capa Fina (TLC)

• Identificación:
  • Cálculo del factor de retención (Rf): Se calcula como Rf = a/b, donde 'a' es la distancia recorrida por el analito y 'b' es la distancia recorrida por el frente del eluyente.
  • Co-cromatografía: Sembrar patrones conocidos junto a las muestras en la misma placa.
• Cuantificación:
  • Medición del diámetro o área de las manchas.
  • Raspado de las manchas, extracción del analito y posterior pesaje o valoración por espectrofotometría.
  • Medición directa en la placa mediante densitometría (reflectometría o transmitancia) utilizando un densitómetro.

Cromatografía en Columna Abierta

• Identificación: Puede realizarse utilizando diferentes eluyentes y comparando los volúmenes de elución con patrones, o analizando las fracciones recogidas mediante otras técnicas (ej. espectroscopía).
• Cuantificación: Tras recoger las fracciones en tubos, medir la concentración del analito en cada fracción relevante, comúnmente mediante espectrofotometría.

Procedimiento de Separación por HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Eficacia)

El sistema funciona de la siguiente manera:

1. La bomba aspira el eluyente (fase móvil) desde los reservorios.
2. El eluyente fluye hacia el inyector.
3. En el inyector, se introduce (inyecta) la muestra, que se incorpora a la corriente del eluyente a alta presión.
4. La mezcla de muestra y eluyente atraviesa la columna cromatográfica, donde ocurre la separación de los componentes basada en sus interacciones diferenciales con la fase estacionaria.
5. Los componentes separados de la mezcla llegan secuencialmente (uno a uno) al detector.
6. El detector genera una señal eléctrica proporcional a la cantidad o concentración de cada componente eluído.
7. Esta señal se registra en función del tiempo, generando un gráfico denominado cromatograma.

Identificación y Cuantificación en Sistemas de Columnas Automatizados (HPLC)

• Identificación: Se basa en el tiempo de retención (el tiempo que tarda un componente en eluir de la columna). Cada pico en el cromatograma corresponde a un componente, y su tiempo de retención se compara con el de un estándar o calibrador conocido, analizado bajo las mismas condiciones.
• Cuantificación: Se basa en el área o la altura del pico en el cromatograma. Una mayor área (o altura) corresponde a una mayor cantidad o concentración del componente. Se compara el área del pico del analito en la muestra con el área del pico obtenido para una concentración conocida del calibrador.

HPLC: Características y Preparación del Eluyente

Características del Eluyente

• Generalmente, es una mezcla de dos o más componentes de diferente polaridad.
• Los reactivos utilizados deben tener un grado de pureza muy alto (grado HPLC).
• Debe ser compatible con la fase estacionaria y los componentes de la muestra.

Preparación del Eluyente

Antes de su uso, el eluyente de HPLC debe ser:

• Filtrado: Para eliminar partículas sólidas que podrían obstruir el sistema o dañar la columna. Se usan filtros de tamaño de poro pequeño (ej. 0,45 µm o 0,22 µm).
• Desgasificado: Para eliminar gases disueltos (como aire) que pueden formar burbujas en el sistema (especialmente en la bomba o el detector), causando fluctuaciones en la línea base y problemas de flujo. La desgasificación se puede realizar por ultrasonidos, burbujeo con helio o vacío.

HPLC: Parámetros Programables y Tipos de Bombas

Parámetros Programables

• Caudal: Se ajusta el flujo del eluyente a través del sistema, medido comúnmente en mililitros por minuto (ml/min).
• Composición del eluyente (en sistemas de gradiente): Se puede programar el cambio de la proporción de los diferentes solventes que componen el eluyente a lo largo del análisis.
• Temperatura de la columna (si se dispone de termostato): Controla la temperatura a la que se realiza la separación.
• Parámetros del detector: Longitud de onda (UV-Vis), potencial (electroquímico), etc.

Tipos de Bombas

• Bomba Isocrática: Proporciona una fase móvil de composición constante durante toda la corrida cromatográfica. Es más simple y económica.
• Bomba de Gradiente (o Sistema de Gradiente): Permite variar la composición de la fase móvil durante el análisis. Esto se logra mezclando dos o más solventes en proporciones variables. Es útil para separar mezclas complejas con componentes de polaridades muy diferentes. Existen sistemas de gradiente de alta presión (mezcla después de las bombas) y de baja presión (mezcla antes de la bomba).