Cromatografía de adsorción para purificar ácidos nucleicos: procedimiento y control de calidad

Resumen

El documento explica la cromatografía de adsorción, que aprovecha la unión de los ácidos nucleicos al vidrio o la sílice en presencia de sales caotrópicas, y describe las etapas de carga, lavado y elución en columna. También detalla cómo evaluar la calidad del material obtenido mediante integridad, pureza y concentración, con los valores de referencia y las fórmulas habituales.

Puntos clave

Los ácidos nucleicos se unen a membranas de sílice o vidrio en presencia de sales caotrópicas.
El lavado con etanol al 70% elimina contaminantes sin soltar el ácido nucleico.
La elución se realiza con agua destilada o tampón TE, que desplaza la capa de hidratación y libera el ácido nucleico.
La integridad se verifica por electroforesis en gel de agarosa: una banda nítida en ADN genómico y un smear indican degradación.
Para ADN, un cociente A260/A280 entre 1.7 y 1.9 indica buena pureza; para ARN, entre 1.8 y 2.1.
La concentración se estima con la absorbancia a 260 nm: 50 ng/µL para ADN bicatenario, 33 ng/µL para monocatenario y 40 ng/µL para ARN.

Ponte a prueba

Cromatografía de Adsorción de Ácidos Nucleicos

La cromatografía de adsorción se basa en la capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos (ác. n.) al vidrio y a la sílice en presencia de sales caotrópicas.

Procedimiento Experimental

Se utilizan membranas de lana de vidrio o perlas de sílice empaquetadas en columnas de polipropileno.

1. Carga de la columna: Las columnas se cargan con el lisado diluido en un tampón con agente caotrópico y se centrifuga. Los ácidos nucleicos quedan unidos a la membrana de la columna, mientras que el medio líquido con proteínas y componentes celulares se elimina.
2. Lavado: Los ácidos nucleicos unidos a la membrana se lavan con etanol (EtOH) al 70% para eliminar restos de contaminantes. Se llena la columna, se centrifuga y se elimina el contenido del tubo colector.
3. Elución: La columna se ajusta en un tubo Eppendorf limpio y se añade sobre la membrana agua destilada o tampón TE. De esta manera, se recupera la capa hidratante de moléculas de H₂O y se separan los ácidos nucleicos. Tras un periodo de incubación y centrifugación, se desecha la columna y se obtiene el tubo Eppendorf con el ácido nucleico purificado.

Calidad de los Ácidos Nucleicos

La calidad se determina mediante tres parámetros fundamentales:

1. Integridad

Determina si el ácido nucleico conserva su tamaño original mediante electroforesis en gel de agarosa:

ADN Genómico: Una banda nítida; un smear indica degradación.
ADN Plásmido: Idealmente una banda en estructura nativa, aunque pueden aparecer estructuras relajadas y dímeros.
ARN: Pequeño smear por el ARNm con dos bandas nítidas de ARNr (28S y 18S) y bandas menores (5.5S y 5S).

2. Pureza

Determina la ausencia de posibles contaminantes mediante el cociente A260/A280, ya que los principales contaminantes tienen un máximo de absorbancia a 280 nm.

Valores ADN: Pureza entre 1.7 y 1.9. Contaminación excesiva si es mayor a 2.0 o si hay concentración elevada de ARN.
Valores ARN: Cociente 260/280 entre 1.8 y 2.1.
Cociente 260/230: A 230 nm se detecta la máxima absorbancia de contaminantes menores. Rango óptimo: 1.5 - 2.2.
Absorbancia a 320 nm: Mide la turbidez de la solución, indicando la presencia de partículas en suspensión.

3. Concentración de Ácidos Nucleicos

Cantidad de ácido nucleico por unidad de volumen de la solución final. Los métodos más utilizados son la absorbancia a 260 nm y la fluorescencia.

Absorbancia A260

ADNbc: 50 ng/µL
ADNmc: 33 ng/µL
ARN: 40 ng/µL

Fórmula: [Ácido Nucleico] = (A260 - A320) · Factor de dilución · Factor de conversión

Conversión de Unidades

ADNbc (picomoles a µg): pmol · pares de bases · 660 / 10⁶
ADNmc (picomoles a µg): pmol · n pares de bases · 330 / 10⁶

Preguntas frecuentes

¿En qué se basa la cromatografía de adsorción de ácidos nucleicos?

Se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos para adsorberse al vidrio y a la sílice en presencia de sales caotrópicas. Esta unión permite separarlos de proteínas y otros componentes celulares.

¿Qué valores de A260/A280 indican una buena pureza del ADN?

Un cociente entre 1.7 y 1.9 indica pureza adecuada en el ADN. Valores superiores a 2.0 o una concentración elevada de ARN señalan contaminación excesiva.

¿Cómo se calcula la concentración de ácido nucleico?

Se usa la absorbancia a 260 nm con la fórmula (A260 - A320) · factor de dilución · factor de conversión. La absorbancia a 320 nm se resta para corregir la turbidez de la solución.