Fundamentos y Métodos de Hibridación de Ácidos Nucleicos

Principios Fundamentales de la Hibridación de Ácidos Nucleicos

La hibridación es el proceso de unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos (AN) por complementariedad de sus secuencias de bases nitrogenadas, resultando en una molécula híbrida bicatenaria. Este proceso puede ocurrir entre cadenas de ADN-ADN, ARN-ARN o ARN-ADN.

Una secuencia diana es una secuencia concreta de bases nitrogenadas que se busca detectar en una muestra problema. Para ello, se utiliza una sonda, que es una cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana.

Desnaturalización de Ácidos Nucleicos

La desnaturalización es el proceso por el cual las dos cadenas de una molécula de ADN bicatenario se separan. Puede inducirse por:

• Agentes químicos: Aumento del pH (medio alcalino), urea o formamida.
• Agentes físicos: Aumento de la temperatura.

La desnaturalización provoca una disminución de la viscosidad de la disolución y un aumento de la absorbancia a 260 nm, conocido como efecto hipercrómico.

Curvas de Desnaturalización/Fusión

Las curvas de desnaturalización o fusión grafican la viscosidad, la absorbancia a 260 nm o la concentración de agente desnaturalizante en función de la temperatura. Se distinguen tres zonas:

• Zona A: Tramo recto, sin pendiente. El ADN se encuentra en doble cadena y la absorbancia a 260 nm es estable.
• Zona B: Desnaturalización progresiva del ADN. La absorbancia a 260 nm aumenta exponencialmente hasta la desnaturalización del 100%, donde el ADN se convierte en dos moléculas monocatenarias.
• Zona C: La temperatura sigue aumentando, pero no hay aumento adicional de la absorbancia a 260 nm, ya que el ADN está completamente desnaturalizado.

La Tm (temperatura de fusión) es la temperatura a la cual el 50% de las moléculas de ADN se han desnaturalizado. Su valor depende de varios factores:

• Moléculas < 500 pb: La Tm aumenta con la longitud de la cadena.
• Moléculas > 500 pb: La Tm depende del contenido de bases G-C.
• Moléculas grandes: A mayor contenido de G-C, mayor Tm (se requiere más temperatura para separar la hélice de ADN debido a los tres puentes de hidrógeno entre G y C).

Renaturalización de Ácidos Nucleicos

La renaturalización es el proceso por el cual dos cadenas de moléculas de ADN separadas por desnaturalización vuelven a reasociarse al disminuir la temperatura, formando de nuevo una doble hélice.

La velocidad de renaturalización depende de:

• Concentración de ADN de partida: A mayor concentración de ADN de partida, mayor número de copias de secuencias complementarias y, por tanto, mayor velocidad de hibridación.
• Tiempo de hibridación: A mayor tiempo de hibridación, mayor probabilidad de que las secuencias complementarias se encuentren y se unan.

Curvas de Renaturalización (Curvas Cot)

Las curvas de renaturalización, también conocidas como curvas Cot, relacionan el producto de la concentración inicial de ADN (Co, en mol/L) y el tiempo de incubación (t, en segundos) con el logaritmo de Cot. El Cot1/2 es el valor de Cot en el que el 50% de las moléculas de ADN se han renaturalizado.

• Procariotas: Presentan genomas con grandes moléculas y secuencias no repetidas. Su curva de renaturalización es sigmoide. El Cot1/2 es directamente proporcional a la longitud del genoma: a mayor longitud del genoma, mayor valor de Cot1/2.
• Eucariotas: Poseen genomas con grandes moléculas y secuencias repetidas. Sus curvas de renaturalización muestran tres sigmoides, reflejando la complejidad de su genoma:
  • Curva A: Corresponde a secuencias altamente repetidas en el genoma, con un Cot1/2 bajo.
  • Curva B: Representa secuencias moderadamente repetidas, con un Cot1/2 moderado.
  • Curva C: Se asocia a secuencias únicas, con un Cot1/2 alto.

Factores que Afectan la Hibridación de ADN

La hibridación de ADN implica que una secuencia de ADN de cadena sencilla (sonda) se une específica y complementariamente a una secuencia de ADN diana, formando un híbrido bicatenario. La Tm de este híbrido depende del contenido de G-C y de otros factores:

1. Fuerza iónica de la solución: Los híbridos tienen una carga negativa en su exterior. La presencia de cationes monovalentes (Na⁺) o divalentes (Ca²⁺ o Mg²⁺) los estabiliza, requiriendo una mayor temperatura para separarlos. La presencia de cationes desplaza la curva de fusión a la derecha y aumenta la Tm.
2. Agentes desnaturalizantes: Compuestos como el DMSO, la formamida o la urea desestabilizan los puentes de hidrógeno. Esto desplaza la curva de fusión a la izquierda y disminuye la Tm.
3. Porcentaje de bases no complementarias (*mismatch*): Si la sonda se une a una secuencia parecida a la diana pero con bases diferentes, se forma un híbrido imperfecto. A mayor porcentaje de *mismatch*, menor Tm.

Sondas de Hibridación de Ácidos Nucleicos

Las sondas de hibridación son oligonucleótidos o fragmentos de ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a la diana.

Tipos de Sondas

Las sondas pueden ser monocatenarias o bicatenarias. Sus características clave son:

• Especificidad: Capacidad de detectar solo la secuencia diana.
• Sensibilidad: Capacidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-secuencia diana.

Sondas de ADN

• Síntesis química: Son de tamaño pequeño, monocatenarias y pueden penetrar tejidos, siendo útiles para FISH (*Fluorescence In Situ Hybridization*). Suelen ser poco sensibles y específicas.
• Técnicas de ADN recombinante: Son de tamaño grande, bicatenarias y más sensibles y específicas. Requieren desnaturalización previa antes de su uso.
• PCR: Permite obtener sondas de tamaño intermedio y bicatenarias.

Sondas de ARN (Ribosondas)

Las ribosondas son monocatenarias. Los híbridos ADN-ARN son más estables que los ADN-ADN, pero son sensibles a la contaminación por ARNasas.

• Síntesis química: Presentan las mismas ventajas e inconvenientes que las sondas de ADN sintetizadas químicamente.
• Transcripción *in vitro*: Se obtienen a partir de fragmentos de ADN con una ARN polimerasa. Son de tamaño intermedio.

Marcaje de Sondas

Para detectar el híbrido formado, la sonda debe estar marcada. Existen dos métodos principales:

1. Detección Directa del Híbrido

• Isótopos radiactivos: Elementos químicos que emiten radiación, como el ³²P y el ³H (tritio). El marcaje se realiza introduciendo dATP radiactivo en la mezcla de nucleótidos. Ofrecen alta sensibilidad, pero generan residuos radiactivos. Son usados en técnicas como Southern Blot (SB), Northern Blot (NB) o Dot Blot (DB). El marcaje radiactivo se revela por autorradiografía con película de rayos X.
• Fluorocromos: Compuestos químicos que emiten luz tras excitación UV. Ejemplos incluyen Rodamina, Fluoresceína, Cianinas y la familia Alexa-Fluor. Son ampliamente utilizados en FISH y se visualizan con microscopio de fluorescencia.

2. Detección Indirecta (Haptenos)

Los haptenos son moléculas pequeñas que se acoplan a las sondas y se detectan indirectamente mediante un sistema de revelado. Ejemplos comunes son la Digoxigenina y la Biotina. Estas técnicas son altamente sensibles y específicas.

• Biotina: Se detecta mediante su unión a la proteína estreptavidina, que a su vez está marcada con un fluorocromo o una enzima.
• Digoxigenina: Se detecta con un anticuerpo anti-digoxigenina, a menudo acoplado a un complejo biotina-estreptavidina-peroxidasa que reacciona con un cromógeno para producir una señal coloreada.

Fases de la Hibridación

El proceso de hibridación generalmente consta de las siguientes fases:

1. Preparación de la muestra y el soporte (Prehibridación): Incluye pasos como la digestión enzimática, electroforesis (EF) y transferencias a un soporte sólido.
2. Hibridación: La membrana se incuba con la solución de hibridación. La temperatura de incubación suele ser de 37, 42 o 65°C. La presencia de cationes monovalentes y una baja concentración de formamida favorecen la formación de híbridos estables. El tiempo de incubación puede variar de 30 minutos a 24 horas.
3. Lavado post-hibridación: Se realizan lavados para eliminar los híbridos imperfectos (*mismatch*) y las sondas no unidas. Las condiciones del medio (temperatura, fuerza iónica y concentración de formamida) se ajustan para optimizar la especificidad.
4. Detección del híbrido: El método de detección varía según el marcador utilizado en la sonda:
   • Radiactivo: La hibridación se realiza sobre un soporte. La autorradiografía impresiona una placa de rayos X. Tras el revelado, se observan las marcas. La intensidad de la señal depende de la intensidad de la radiación emitida por los isótopos y el tiempo de exposición.
   • Fluorocromo: Utilizado comúnmente en hibridación *in situ*, se visualiza con un microscopio de fluorescencia.
   • Haptenos: Empleados en todo tipo de técnicas. Se detectan mediante métodos inmunohistoquímicos, utilizando anticuerpos (AC) anti-hapteno marcados con un fluorocromo o una enzima que cataliza una reacción que produce un producto coloreado.

Técnicas de Hibridación

En las técnicas de hibridación en soporte sólido, la muestra o la sonda se inmovilizan en un soporte antes de la hibridación.

Dot Blot

El Dot Blot utiliza una membrana de nitrocelulosa o nailon como soporte. Permite detectar secuencias de ADN o ARN en una mezcla compleja, sin proporcionar información sobre el tamaño de las moléculas. Es útil para estudiar varias muestras a la vez en distintas zonas de la membrana. Se pueden usar sondas marcadas con haptenos o isótopos radiactivos.

1. Aplicación de la muestra al soporte: La membrana se humedece con tampón durante 10 minutos y se retira el exceso con papel de filtro. Se monta un sistema de vacío y se carga la muestra.
   • Para ADN: Se desnaturaliza con NaOH y EDTA a 100°C, se neutraliza, se carga en la posición deseada de la membrana y se aplica vacío. Luego se lava con NaOH. Se desmonta el sistema de vacío.
   • Para ARN: El proceso es similar, pero con una menor concentración de NaOH.

   Una vez extraída, la membrana de nitrocelulosa se seca a 80°C y la de nailon se seca con luz UV para anclar los ácidos nucleicos a la membrana.

2. Prehibridación: La membrana se incuba con una solución de prehibridación para bloquear uniones inespecíficas. Esta solución tiene la misma composición que la solución de hibridación, pero sin la sonda.
3. Hibridación: Se introduce la membrana en la solución de hibridación y se incuba de 4 a 24 horas. Si el ADN es bicatenario, debe desnaturalizarse previamente mediante calentamiento a 95-100°C y enfriamiento rápido en hielo.
4. Lavado post-hibridación: Se realizan 2 o 3 lavados con diferentes soluciones para eliminar la sonda no unida.
5. Detección del híbrido:
   • Radiactivo: Mediante autorradiografía con placa de rayos X.
   • Haptenos: Mediante métodos cromogénicos.

Aplicaciones de la Hibridación

Las técnicas de hibridación tienen diversas aplicaciones, incluyendo:

• Rastreo: Detección de ARNm en células tumorales, estudio de la expresión génica y detección de secuencias extrañas en una muestra.
• Dot Blot con Oligonucleótidos Alelo-Específicos (ASO Dot Blot): Permite estudiar variantes alélicas de genes y detectar mutaciones. La muestra se inmoviliza en la membrana. El gen de interés se amplifica por PCR para obtener millones de copias y se fija a la membrana. Luego se hibrida con oligonucleótidos específicos del alelo, usando una sonda para cada alelo.
• Dot Blot Inverso: En esta variante, los oligonucleótidos específicos de los alelos se inmovilizan en la membrana. La muestra, amplificada por PCR y marcada (por ejemplo, con radioisótopos), se hibrida con los oligonucleótidos inmovilizados. Esta técnica es muy útil para identificar mutaciones genéticas.