Fundamentos y Métodos Clave de Electroforesis en Bioquímica Analítica

Principios y Técnicas Avanzadas de Electroforesis

Fenómenos Electroforéticos Clave

Electroósmosis

La electroósmosis es el movimiento del disolvente respecto de una superficie sólida, producido por la aplicación de un campo eléctrico. Este fenómeno es crucial en la electroforesis capilar.

• Las especies con carga positiva viajan hacia el cátodo con su velocidad electroforética, a la cual se suma la velocidad del flujo electroosmótico.
• Las especies con carga negativa viajan inicialmente hacia el cátodo con su velocidad electroforética, pero deben compensar la tendencia electroosmótica que las empuja en dirección contraria con una velocidad electroosmótica opuesta.
• Las especies neutras, al no poseer carga, viajan con una velocidad total igual a la velocidad electroosmótica.

Técnicas Electroforéticas Especializadas

Isotacoforesis

En la isotacoforesis, se busca la ausencia de electroósmosis, lo cual se logra recubriendo la pared interna del capilar con un polímero hidroxilado. Esta técnica es menos utilizada y sirve principalmente para separar cationes entre sí y aniones.

Enfoque Isoeléctrico (IEF)

El enfoque isoeléctrico es una técnica fundamental para la separación de proteínas, basándose en su punto isoeléctrico (pI). Para ello, el flujo electroosmótico se anula recubriendo el capilar. Se crea un gradiente de pH rellenando el capilar con una mezcla de anfolitos que cubren todos los valores de pH. Al aplicar un campo eléctrico, los anfolitos se reordenan, desplazándose cada uno hacia su polo correspondiente hasta alcanzar su pI.

Inmunoelectroforesis

La inmunoelectroforesis es una combinación de dos técnicas: la separación electroforética y el inmunoensayo. Se realiza como una electroforesis en gel de agarosa y consta de tres etapas principales:

1. Electroforesis: Separación inicial de los componentes.
2. Difusión radial: Los anticuerpos se difunden desde un pozo.
3. Inmunoprecipitación: Formación de arcos de precipitación donde antígeno y anticuerpo reaccionan.

Blotting

Una vez terminada la electroforesis (por ejemplo, PAGE), se puede obtener más información sobre la identidad de las macromoléculas si estas se transfieren desde el gel a una membrana. Este proceso, conocido como blotting, consiste en transferir la macromolécula hasta una membrana, dejando el gel seco. La transferencia puede ser por difusión o por capilaridad. Existen varios tipos de blotting, clasificados según la macromolécula transferida:

• Southern blotting: Separación y transferencia de ADN.
• Northern blotting: Separación y transferencia de ARN.
• Western blotting: Separación y transferencia de proteínas.
• Southwestern blotting: Separación y transferencia de proteínas en membranas con secuencias específicas de ADN.

Tipos de Soportes en Electroforesis

Soportes No Restrictivos (Tipo 1)

Estos soportes actúan únicamente como vehículo o soporte de la disolución electrolítica. La separación de las especies se basa principalmente en la relación masa/carga. Ejemplos comunes incluyen la agarosa y el acetato de celulosa.

Soportes Restrictivos (Tipo 2)

Los soportes restrictivos participan activamente en el proceso de separación, ya que actúan como un tamiz molecular. Según el tamaño de su poro, permiten una separación de las macromoléculas en función de su carga, tamaño y forma, independientemente del potencial. Restringen el paso de moléculas grandes, estabilizan el medio minimizando el transporte por convección y difusión, y actúan como tamiz molecular, permitiendo el paso de analitos no solo por la relación masa/carga, sino también por su volumen.

Consideraciones Adicionales en Electroforesis

Separación en Condiciones Desnaturalizantes y Nativas

• En condiciones desnaturalizantes: La separación se realiza principalmente por peso molecular.
• En condiciones nativas: La separación se basa en la forma, carga y tamaño de las moléculas.

Introducción de Muestra

La introducción de la muestra se lleva a cabo por el extremo opuesto al polo negativo. El volumen de muestra no debe exceder de 5 a 50 µL. La introducción puede ser de tipo electrocinética o hidrodinámica (por gravedad o presión).