Fundamentos y Mecanismos de Separación en Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

Técnicas de Separación en Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

1. Adsorción

Fundamento de la Separación

El fundamento de la separación radica en la capacidad del soluto para adsorberse sobre la fase estacionaria. La separación se produce por la diferencia de polaridad de los solutos.

• La fase estacionaria es generalmente polar, por lo tanto, retendrá más fuertemente a los solutos más polares.
• La interacción con la fase estacionaria ocurre en el grupo funcional. Esto permite separar compuestos con distinto grupo funcional, pero no dos compuestos con el mismo grupo funcional.

Mecanismo de Elución y Fuerza de Desplazamiento

La fase móvil (disolvente, Dv) compite con el soluto (sol) por los sitios activos del cambiador. En función de la tendencia a adsorberse, el soluto se desplaza hacia el disolvente o al contrario. Esto se denomina fuerza de desplazamiento.

Al aumentar la polaridad del disolvente (Dv), la polaridad de la fase móvil aumenta. Debido a esto, el disolvente se retendrá más, lo que provoca una disminución en los tiempos de retención del soluto.

Si el soluto se retiene fuertemente en el cambiador, se debe usar un disolvente con polaridad elevada para que eluya.

Trabajo en Gradientes

Si se utilizan mezclas de disolventes, es preferible trabajar en gradientes. Esto implica variar la composición de la fase móvil a lo largo de la separación de los solutos:

• Al comienzo, se utiliza un disolvente con baja polaridad.
• Se va aumentando progresivamente la polaridad, consiguiendo que salgan primero los solutos que se retienen poco y, posteriormente, los que se retienen más fuertemente.

2. Reparto o Partición (Líquido-Líquido)

Fundamento de la Separación

El fundamento de la separación es la diferencia de solubilidad de los solutos en la fase móvil y en la fase estacionaria. Por ejemplo, un soluto apolar se disuelve mejor con un disolvente apolar.

Soporte y Fijación

Se utiliza un soporte para retener la fase estacionaria, como el gel de sílice, ya que es un material poroso que forma una película que mantiene la fase estacionaria fija.

La fase estacionaria recubre al soporte. En función de la forma en que se retenga la fase estacionaria sobre el soporte, tendremos:

• Fase estacionaria absorbida.
• Fase estacionaria fijada químicamente.

Para separar solutos, también se trabaja en gradiente de disolvente.

Control de Variables en la Separación Cromatográfica

Gradiente de Temperatura (Tª)

Efecto de la Temperatura

El fundamento de la separación en la columna se debe a la diferencia de volatilidad de los solutos y su solubilidad en la fase estacionaria; por lo tanto, el control de la temperatura es importante.

• Al aumentar la temperatura, disminuyen los tiempos de retención y los picos del cromatograma se juntan porque los solutos salen a tiempos parecidos.
• Si la temperatura es baja, los solutos saldrán más separados, pero los tiempos de retención serán más largos.

Optimización

La solución es trabajar en gradientes de temperatura y aumentar la temperatura poco a poco.

Inconveniente

Cada vez que se comienza el gradiente, se debe dejar que la columna alcance la temperatura de las condiciones iniciales, lo que implica una pérdida de tiempo.

Detección Cromatográfica

Detector de Captura Electrónica (DCE)

Principio de Funcionamiento

El Detector de Captura Electrónica se basa en la captura de los electrones libres procedentes de la ionización del gas portador, lo que provoca una disminución de la intensidad de corriente de ionización.

Entre el ánodo y el cátodo se establece una diferencia de potencial suficiente para recoger los electrones libres.