Fundamentos y Evolución de la Secuenciación de Ácidos Nucleicos: Métodos Clásicos y Generaciones Tecnológicas

La Secuenciación de Ácidos Nucleicos: Definición y Desarrollo Histórico

La secuenciación de ácidos nucleicos es el proceso mediante el cual se determina la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico (ADN o ARN). Las secuencias se transcriben como cadenas de letras, correspondientes a las iniciales de las bases nitrogenadas, leídas desde el extremo 5’ al 3’.

Evolución de las Técnicas de Secuenciación

Las técnicas utilizadas desde 1980 hasta la actualidad se clasifican en distintas generaciones:

1. Técnicas basadas en reacciones químicas o enzimáticas (Primera Generación Clásica):
   • Método de Maxam y Gilbert (Químico).
   • Método de Sanger o método enzimático de determinación de cadena.
2. Secuenciación Automática (Primera Generación Moderna): Desarrollada con el descubrimiento de la PCR y la electroforesis capilar.
3. Secuenciación de Segunda Generación (Next-Generation Sequencing - NGS): Desarrollada en la década pasada, incluyendo procesos como la pirosecuenciación.
4. Secuenciación de Tercera Generación: Actualmente en desarrollo, enfocada en procesos de secuenciación de molécula única.

Método Químico de Maxam y Gilbert

Este método se basa en la modificación de las bases nitrogenadas mediante reacciones químicas específicas. Permite secuenciar fragmentos cortos de ADN, aunque requiere grandes cantidades de la molécula de ADN purificada.

Protocolo del Método Maxam y Gilbert

1. Marcaje del Extremo: Se marca uno de los extremos con ³²P, generalmente el extremo 5’. Para ello, se elimina el fosfato de este extremo y posteriormente se fosforila con ATP marcado con ³²P.
2. Reacciones de Modificación Química: La muestra se divide en cuatro partes para realizar modificaciones específicas de las bases nitrogenadas:
   • Tubo 1: Modificación de las guaninas (G).
   • Tubo 2: Modificación de las purinas (adenina (A) y guanina (G)).
   • Tubo 3: Modificación de las citosinas (C) y timinas (T).
   • Tubo 4: Modificación de las citosinas (C).

   Una vez modificadas las bases, se añade *piperidina* a los tubos, lo que rompe las cadenas a nivel de las bases modificadas. Por lo tanto, se obtiene en cada tubo una mezcla de fragmentos de distinto tamaño, marcados y no marcados.

3. Electroforesis: Los productos de los cuatro tubos corren en paralelo en el mismo gel de poliacrilamida.
4. Autorradiografía del Gel: Se observa una serie de bandas oscuras en cada una de las calles, correspondientes a los fragmentos marcados de cada tubo.
5. Interpretación: La lectura de la secuencia se inicia en la parte inferior del gel, que corresponde al extremo 5’.

Métodos Enzimáticos de Terminación en Cadena (Método Sanger)

Este método se basa en reacciones de polimerización de cadenas complementarias a la cadena que se desea secuenciar. El primer método de este tipo fue desarrollado por Frederick Sanger.

A la mezcla de reacción se añaden didesoxinucleótidos fosfato (ddNTP). Estos son nucleótidos que carecen del grupo OH en el carbono 3’, por lo que, cuando se incorporan a una cadena en crecimiento, detienen la síntesis.

Protocolo del Método Sanger

1. Reacciones de Polimerización: La muestra se divide en cuatro partes para realizar cuatro reacciones de polimerización, una por cada base nitrogenada. Cada tubo contiene:
   • ADN molde (el ADN que se quiere secuenciar).
   • ADN polimerasa.
   • Los cuatro dNTP (desoxinucleótidos trifosfato).
   • Uno de los cuatro ddNTP en menor concentración que el dNTP.
   • Un cebador marcado en el extremo 5’ con ³²P.

   Durante la reacción de polimerización, la ADN polimerasa añade nucleótidos al cebador hasta que se incorpora un ddNTP, deteniendo la elongación de la cadena.

2. Electroforesis: Las cadenas de nueva síntesis se separan del ADN molde (mediante desnaturalización con calor) y se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida. Los productos de las cuatro reacciones se hacen correr en paralelo en el mismo gel.
3. Autorradiografía del Gel: Se obtienen bandas oscuras en las cuatro calles del gel, correspondientes a los distintos fragmentos obtenidos en las reacciones de polimerización.